NPDC1抗体的应用

背景^[1-3]

NPDC1抗体是一种可以特异性结合NPDC1的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的NPDC1蛋白。NPDC1抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

NPDC1，即细胞周期蛋白D1，别名包括BCL1、PRAD1、U21B31、D11S287E。NPDC1由人类NPDC1基因编码，该基因位于11号染色体的q13.3区域。NPDC1是细胞周期中的关键调节因子，其编码的蛋白质属于高度保守的细胞周期蛋白家族，这些蛋白在细胞周期中的丰度具有显著周期性。NPDC1与CDK4或CDK6形成复合物并作为其调节亚基，其活性对于细胞周期G1/S过渡是必需的。NPDC1与肿瘤抑制蛋白Rb相互作用，并且这个基因的表达受到Rb的正向调控。NPDC1的突变、扩增和过度表达会改变细胞周期的进程，这在多种人类癌症中经常观察到。NPDC1在细胞增殖、分化和凋亡过程中起着关键作用，其异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关，是多种癌症治疗的重要靶点。

NPDC1抗体

NPDC1抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（NPDC1抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(NPDC1抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

NPDC1抗体可以用于NPDC1在伴有神经浸润的结直肠癌中的表达及临床意义

探索NPDC1在结直肠癌中的表达水平及临床意义有可能为肿瘤研究提供新的思路与方法。

研究方法:1.筛选与结直肠癌神经浸润相关的基因并在多个数据库平行验证通过ENSEMBL数据库得到与神经、突触相关的基因集,结合TCGA数据库筛选出可能与神经浸润、预后相关的基因,使用随机森林的方法与之取交集定位目的基因NPDC1,进一步通过Log2(TPM+0.01)配对T检验、Oncomine数据库、TIMER数据库和HPA数据库验证NPDC1的表达情况。2.NPDC1基因功能分析使用Xena整理的TCGA-COAD数据进行spearman相关性分析以研究NPDC1的基因功能,以|Rho>0.3|P<0.05的阈值把正负相关基因进行GSEA、GSVA、GO、KEGG富集分析以寻找基因可能参与的信号通路。3.临床验证NPDC1表达水平和分析临床意义收集63例从2016年5月至2017年12在吉林大学第二医院进行手术患者的石蜡标本,以及10例2022年10月至2022年12月新鲜结直肠癌切除组织标本。通过Rt-q PCR、NPDC1抗体WB和IHC分析NPDC1在结直肠正常组织、癌旁组织和癌组织中的表达情况,并分析NPDC1表达与临床病理特征和生存预后之间的关系。

NPDC1抗体研究结果:1.NPDC1在结直肠癌中高表达ENSEMBL数据库再结合TCGA-COAD样本集通过单因素Cox回归分析和Kaplan Meier plotter法联合分析筛选出Cox-p Value与KM-p Value均小于0.05的13个基因:UNC5D、CHD5、SALL1、MANF、ADRA2B、DLX2、NTF4、PTPRD、NPDC1、LRRN4、NPAS1、SYN1、SYT8,最后与随机森林真实重要性大于0.25的基因取交集后,最终得到NPDC1基因可能与结肠癌神经浸润和生存预后精密关联。并且通过Oncomine数据库、TIMER2.0数据库和HPA数据库进一步验证了NPDC1基因在结直肠癌中高表达。2.NPDC1基因功能分析基因相关性分析发现NPDC1与多种调节细胞周期、离子通道蛋白、信号通路受体明显正相关,与多种细胞凋亡、细胞自噬相关蛋白呈负相关,尤其与HMG20B具有很强相关性,HMG20B被认为是细胞准确进入G2期和有丝分裂所必须的,提示NPDC1可能通过调控细胞周期从而调控结肠癌的发生发展。GO、KEGG、GSEA和GSVA分析发现NPDC1主要与一些细胞器调控和营养代谢相关的通路有关,比如主要富集在线粒体调控、细胞递送组装调控、Notch信号通路、磷脂酶D信号通路、糖酵解、P53通路等信号通路。3.NPDC1在临床组织中的表达验证Rt-q PCR检测发现NPDC1 m RNA在结直肠癌组织中表达水平高于正常组织,NPDC1抗体WB和IHC进一步验证了结直肠癌组织中NPDC1蛋白在表达水平高于正常组织和癌旁组织。并且NPDC1的高表达与结直肠癌神经浸润具有相关性(P<0.05),与性别、年龄、血管侵犯、TNM分期、CEA水平等没有相关性(P>0.05)。

参考文献

[1]Efficacy of Retreatment with Oxaliplatin-Based Regimens in Metastatic Colorectal Cancer Patients:The RETROX-CRC Retrospective Study[J].Amatu Alessio;Mauri Gianluca;Tosi Federica;Bencardino Katia;Bonazzina Erica;Gori Viviana;Ruggieri Lorenzo;Arena Sabrina;Bardelli Alberto;Marsoni Silvia;Siena Salvatore;SartoreBianchi Andrea.Cancers.2022

[2]Nerve Dependence in Colorectal Cancer[J].Zhang Lincheng;Yang Ludi;Jiang Shuheng;Yu Minhao.Frontiers in Cell and Developmental Biology.2022

[3]Cancer statistics,2022[J].Siegel Rebecca L.;Miller Kimberly D.;Fuchs Hannah E.;Jemal Ahmedin.CA:A Cancer Journal for Clinicians.2022

[4]Ensembl 2022.[J].Cunningham Fiona;Allen James E;Allen Jamie;AlvarezJarreta Jorge;Amode M Ridwan;Armean Irina M;AustineOrimoloye Olanrewaju;Azov Andrey G;Barnes If;Bennett Ruth;Berry Andrew;Bhai Jyothish;Bignell Alexandra;Billis Konstantinos;Boddu Sanjay;Brooks Lucy;Charkhchi Mehrnaz;Cummins Carla;Da Rin Fioretto Luca;Davidson Claire;Dodiya Kamalkumar;Donaldson Sarah;El Houdaigui Bilal;El Naboulsi Tamara;Fatima Reham;Giron Carlos Garcia;Genez Thiago;Martinez Jose Gonzalez;GuijarroClarke Cristina;Gymer Arthur;Hardy Matthew;Hollis Zoe;Hourlier Thibaut;Hunt Toby;Juettemann Thomas;Kaikala Vinay;Kay Mike;Lavidas Ilias;Le Tuan;Lemos Diana;Marugán JoséCarlos;Mohanan Shamika;Mushtaq Aleena;Naven Marc;Ogeh Denye N;Parker Anne;Parton Andrew;Perry Malcolm;Piližota Ivana;Prosovetskaia Irina;Sakthivel Manoj Pandian;Salam Ahamed Imran Abdul;Schmitt Bianca M;Schuilenburg Helen;Sheppard Dan;PérezSilva JoséG;Stark William;Steed Emily;Sutinen Kyösti;Sukumaran Ranjit;Sumathipala Dulika;Suner MarieMarthe;Szpak Michal;Thormann Anja;Tricomi Francesca Floriana;UrbinaGómez David;Veidenberg Andres;Walsh Thomas A;Walts Brandon;Willhoft Natalie;Winterbottom Andrea;Wass Elizabeth;Chakiachvili Marc;Flint Bethany;Frankish Adam;Giorgetti Stefano;Haggerty Leanne;Hunt Sarah E;IIsley Garth R;Loveland Jane E;Martin Fergal J;Moore Benjamin;Mudge Jonathan M;Muffato Matthieu;Perry Emily;Ruffier Magali;Tate John;Thybert David;Trevanion Stephen J;Dyer Sarah;Harrison Peter W;Howe Kevin L;Yates Andrew D;Zerbino Daniel R;Flicek Paul.Nucleic acids research.2021

[5]赵林先.NPDC1在伴有神经浸润的结直肠癌中的表达及临床意义[D].吉林大学,2023.