USF1抗体的应用

背景^[1-3]

USF1抗体是一种可以特异性结合PDX1的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的PDX1蛋白。USF1抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

上游刺激因子1（USF1），也称为B类碱性螺旋-环-螺旋蛋白11。它是一种主要的晚期转录因子1.USF1是碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链家族的成员，可以作为细胞转录因子发挥作用。编码的蛋白质可以通过富含嘧啶的起始（Inr）元件和E盒基序激活转录。USF1与家族性联合高脂血症（FCHL）有关。USF1存在两种亚型，计算的USF1分子量为32 kDa和27 kDa。USF1具有乙酰化形式和磷酸化形式，因此USF1的分子量可以迁移到约40 kDa。

USF1抗体

USF1抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（USF1抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(USF1抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

USF1抗体可以用于USF1下调结直肠癌中FHL2基因转录调控的机制研究

探讨USF1在结直肠癌发生中的作用及其对FHL2基因的转录调控作用与机制。研究内容

方法:一、利用RT-PCR和USF1抗体Western blot方法检测不同的人胃肠道肿瘤细胞中USF1的表达情况;二、利用USF1抗体免疫组化方法检测不同分期的人结直肠肿瘤组织中USF1的表达情况;三、利用EMSA和ChIP方法检测USF1蛋白与FHL2基因启动子的结合情况;四、利用基因克隆技术构建FHL2启动子的真核表达载体,利用定点突变技术构建FHL2启动子的突变载体;五、利用双荧光素酶报告基因系统检测定点突变FHL2启动子的E-box位点后,突变载体荧光素酶活性的变化;六、利用基因克隆技术构建并鉴定重组质粒pcDNA3.1（+）-USF1;七、利用RT-PCR和USF1抗体Western blot方法检测过表达或者干扰USF1后FHL2的表达情况;八、利用双荧光素酶报告基因系统检测过表达或者干扰USF1后FHL2启动子的荧光素酶活性。

USF1抗体结果:一、USF1在不同的人胃肠道肿瘤细胞株中具有不同的表达水平8株人胃肠道肿瘤细胞均表达USF1蛋白。USF1在蛋白水平的表达量以SW480、SW620和LoVo细胞最高,而在KATOⅢ细胞中的含量最低;USF1在mRNA水平的表达量以SW480、SW620、LoVo和HCT116细胞最高,而在KATOⅢ细胞中的含量最低。二、USF1在人结直肠肿瘤组织的表达显著增强USF1在人正常结直肠黏膜中蛋白呈低表达;在有不典型增生的人腺瘤组织中,USF1的表达相对于正常人结直肠黏膜开始增强;而在人结直肠癌组织中其表达显著增强,差别有统计学意义（P=0.0018）。USF1蛋白的表达在不同Dukes'分期、不同分化程度的结直肠癌组织之间无明显差异（P＞0.05）。三、USF1对FHL2基因的转录具有调控作用1、USF1能够与FHL2启动子的上游E-box位点特异性结合EMSA实验证实了SW480细胞的核蛋白与-817bp/-812bp处E-box位点结合形成了DNA-核蛋白复合物,且竞争性探针可以抑制此复合物的形成。ChIP实验证实了SW480细胞中USF1蛋白能与FHL2基因DNA结合。2、定点突变FHL2启动子的E-box位点后,突变载体的荧光素酶活性较未突变组明显升高双荧光素酶报告基因系统证实在SW480细胞和LoVo细胞中4个FHL2基因启动子报告载体的转录活性不同,其中pluc595的荧光素酶活性值最高。对FHL2启动子区域-817/-812bp处的E-box进行定点突变,使其由CAGCTG序列变为TAATTG,从而破坏E-box位点的序列,使其不能与USF1结合。定点突变FHL2启动子后,突变载体荧光素酶活性较未突变组明显升高（p＜0.05）。3、构建重组质粒pcDNA3.1（+）-USF1,并筛选出USF1高表达的SW480细胞和LoVo细胞,将其命名为SW480USF1和LoVoUSF1。4、在SW480USF1和LoVoUSF1中,FHL2表达水平显著降低（P＜0.05）。5、在SW480细胞和LoVo细胞中采用USF1 siRNA干扰USF1的表达后,FHL2表达水平显著增高（P＜0.05）。6、在SW480USF1和LoVoUSF1中,FHL2基因启动子的转录活性下降。7、在SW480细胞和LoVo细胞中,采用USF1 siRNA干扰USF1的表达后,FHL2基因启动子的转录活性上调。

参考文献

[1]Suppression of FHL2 Expression Induces Cell Differentiation and Inhibits Gastric and Colon Carcinogenesis[J].Jide Wang;;Yi Yang;;Harry H.X.Xia;;Qing Gu;;Marie C.M.Lin;;Bo Jiang;;Ying Peng;;Guoqing Li;;Xiaomeng An;;Yali Zhang;;Zehao Zhuang;;Zhenshu Zhang;;Hsiang Fu Kung;;Benjamin C.Y.Wong.Gastroenterology,2007(3)

[2]FHL2 interacts with both ADAM‐17 and the cytoskeleton and regulates ADAM‐17 localization and activity[J].MatthiasCanault;EdwigeTellier;BernadetteBonardo;EricMas;MoniqueAumailley;IrèneJuhan‐Vague;GillesNalbone;FranckPeiretti.J.Cell.Physiol.,2006(2)

[3]The SRF Target Gene Fhl2 Antagonizes RhoA/MAL-Dependent Activation of SRF[J].Ulrike Philippar;;Gerhard Schratt;;Christoph Dieterich;;Judith M.Müller;;Petra Galgóczy;;Felix B.Engel;;Mark T.Keating;;Frank Gertler;;Roland Schüle;;Martin Vingron;;Alfred Nordheim.Molecular Cell,2004(6)

[4]Recruitment of Histone Modifications by USF Proteins at a Vertebrate Barrier Element[J].Adam G.West;;Suming Huang;;Miklos Gaszner;;Michael D.Litt;;Gary Felsenfeld.Molecular Cell,2004(3)

[5]张艳.USF1下调结直肠癌中FHL2基因转录调控的机制研究[D].南方医科大学,2009.