羧肽酶B的结构特性与活性测定

羧肽酶B是一种外分泌蛋白酶, 属于金属羧肽酶A和羧肽酶B (CPA/CPB) 家族, 每分子含有一个Zn原子, 可选择性水解蛋白或多肽羧基端的精氨酸和赖氨酸。胰脏中羧肽酶A和羧肽酶B的最基本功能是在肠道内分解肽段, 肽段由胰蛋白酶降解蛋白质产生, 羧肽酶A对于芳香族或脂肪类氨基酸残基有最佳的切割能力, 羧肽酶B优先切割碱性氨基酸, 但同时羧肽酶B也能切割一些非碱性的氨基酸残基，在生物化学基础研究领域中应用广泛。

图1 羧肽酶B的性状图

结构特性

羧肽酶B(CPB)在胰腺中以无活性的酶原形式合成, 羧肽酶原B的分子质量为46ku, 由401个氨基酸组成;CPB分子质量为35ku, 由306个氨基酸组成。胰腺羧肽酶原B有两个结构域:催化结构域和激活部分。激活部分保护着活性部位。位于活性中心的Arg-145和激活部分的Asp-41之间形成盐桥, 以防底物的C端羧基基团结合到Arg-145上。酶原的Asp-41突变为Asn或Ala, 可使酶原具有低的内在酶活性, 说明少量底物结合到底物结合部位, 因此, Asp-41和Asp-145之间的盐键形成有助于保持酶原的无活性状态。羧肽酶B在科研中的应用主要基于其切割特性，它可以用于蛋白质和肽的测序, 在医学上用于诊断胰腺炎。在重组胰岛素的生产中,活性胰岛素的产生也要依赖于羧肽酶B的切割。[1]

分离方法

Folk等早在1960年已从猪和牛的胰腺分离和鉴定了羧肽酶B。至今,已得到分离纯化和鉴定的羧肽酶B有来源于人胰腺、骆驼、鸵鸟、非洲肺鱼、鲤鱼、、鲶鱼、白虾、小龙虾、海星等。

活性测定

该方法基于羧肽酶B可以水解马脲酰-L-精氨酸生成马尿酸,而马尿酸 (hippuric acid) 和马脲酰-L-精氨酸 (hippuryl-L-arginine) 具有不同的吸收光谱。通常的分析方法如下:试验当天新鲜配制的0.001mol/L马脲酰L-精氨酸的盐溶液, 总测定体系3ml, 254nm处调零。加入的羧肽酶B溶液的体积5~20μl, 立即调节灵敏旋钮置光吸收为零, 然后根据所需的时间频繁记录增加的吸收值，0.001mol/L的马尿酸缓冲盐溶液作为常规的标准对照。整个分析在室温进行 (25℃) 。最高达40%的水解反应符合零级反应动力学, 因此, 酶的浓度调整到10min内水解反应不超过30%。100%水解的光吸收值为0.36, 在测定范围内, 数据显示底物的水解速率与酶浓度呈明显的正比关系。蛋白浓度和含量可通过测定获得, 活力单位定义为在0.001mol/L的底物浓度下每分钟的底物水解百分数。[1]

金属离子对羧肽酶B活性的影响

Mn2+, Zn2+, Mg2+, Ca2+都能够不同程度的提高酶的活力, 几乎所有来源的羧肽酶B在和Co2+孵育一段时间之后, 活力都大大提高。Cu2+可以部分抑制重组羧肽酶B的活力, 而在Hg2+的存在下, 重组羧肽酶B的活力几乎全部丧失。一些无机盐在pH=8.0时对羧肽酶B显示抑制作用,抑制作用顺序为NaI, KSCN, NaBr, MgSO4, NaCl, KCl, 和NaNO3, 其中, NaCl, KCl和Na2SO4在pH=7.2和pH=8.0时的抑制作用相同，0.9mol/L NaCl (1×10-4mol/L 马尿酰-L-精氨酸) 可降低降解速率50%。[1]

稳定性

对于不同来源的羧肽酶B活性研究表明，羧肽酶B的活力在pH8左右时为最大值,偏酸性和偏碱性的条件都会使酶活造成不同程度的损失。当pH≥12时,羧肽酶B的活力完全丧失。重组羧肽酶B在pH5时, 活力接近零, 表明重组CPB的等电点就在pH=5左右。在一定的温度范围 (<60℃) 内, 羧肽酶B的活力随着温度的升高而上升, 随后下降。温度对活力的增效作用在所有来源的CPB中是一个普遍现象。比较来源于猪、海星等的CPB来说, 重组CPB的热稳定性要差一些。[1]

参考文献

[1] 李素霞,张晓彦,张映新,等.羧肽酶B研究进展[J].药物生物技术, 2006, 13(4):4.