HNRNPL抗体的应用

背景^[1-3]

HNRNPL抗体是一种可以特异性结合PDX1的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的PDX1蛋白。HNRNPL抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

异质核核糖核蛋白L（hnRNP L）是异质核核糖核蛋白（hnRNP）复合物的一个组成部分，该复合物为前体mRNA在细胞质中成为功能性、可翻译的mRNA之前所经历的加工事件提供底物。它与大多数新生的转录本有关，包括两栖动物lampbrush染色体的标志性巨大环的转录本。hnRNP L的两种亚型是通过选择性剪接产生的。人类hnRNPL基因编码一种位于核质和细胞质中的蛋白质。该抗体可识别hnRNP L蛋白的两种同工型。

HNRNPL抗体

HNRNPL抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（HNRNPL抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(HNRNPL抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

HNRNPL抗体可以用于应用蛋白质组技术鉴定急性白血病患者和正常人血清中的自身抗体

应用蛋白质组技术鉴定急性白血病中引起体液免疫反应的蛋白质。将21个急性白血病患者，20个实体瘤患者，22个非肿瘤患者的血清样本用于与双向电泳分离的急性白血病细胞蛋白质进行HNRNPL抗体免疫印迹反应。在15个急性白血病患者血清中发现(15／21，71％)蛋白质Rho-GDI2的自身抗体。而仅在1个实体瘤患者(1／20，5％)和一个非肿瘤患者(1／22，4.5％)血清中发现该蛋白质的自身抗体。我们还发现另外四种蛋白质(γ-actin，CAPZA1，hnRNPL和Tubulin-α)也可以被急性白血病患者血清所识别，构成了急性白血病自身免疫反应的主要靶抗原群。Rho-GDI2自身抗体其他急性白血病患者血清中的发现提示我们采用的蛋白质组技术在建立基于血清试验的白血病筛查和诊断方法方面有重要应用价值。在研究白血病特异性自身抗体的过程中我们发现正常人循环系统中也存在很多自身抗体，虽然自身抗体在个体之间存在着很大差异，但有一些自身抗体在正常人群中以较高频率出现。为了研究正常人体内的自身抗体，我们用蛋白质组学方法鉴定了36名来自北京地区正常人血清中的自身抗体，发现有超过50％的血清样品中有α-enolase和异源核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L hnRNP L)的自身抗体，超过20％的血清样品中有AnnexinⅡ，F-actin capping protein beta subunit(CAPZB)和Calreticulin的自身抗体。某些抗原蛋白质的自身抗体在过去的研究中曾被发现与自身免疫性疾病以及肿瘤有一定的相关性，正常人血清中自身抗体的鉴定可以为疾病特异性自身抗体的鉴定提供重要的参考和对照。

参考文献

[1]he relationship of BRMS1 and RhoGDI2 gene expression to metastatic potential in lineage related human bladder cancer cell lines[J].M.Jabed Seraj;;Michael A.Harding;;John J.Gildea;;Danny R.Welch;;Dan Theodorescu.Clinical and Experimental Metastasis,2000(6)

[2]Specific down-regulation of annexin II expression in human cells interferes with cell proliferation[J].Yangping Chiang;;Angie Rizzino;;Zita A.Sibenaller;;Marc S.Wold;;Jamboor K.Vishwanatha.Molecular and Cellular Biochemistry,1999(1)

[3]Annexin II tetramer:structure and function[J].David M.Waisman.Molecular and Cellular Biochemistry,1995(1)

[4]Antibodies to heterogeneous nuclear ribonucleoproteins in sera from patients with rheumatic autoimmune diseases[J].Moncef Zouali;;AndréEyquem.Journal of Clinical Immunology,1984(3)

[5]李卫华.应用蛋白质组技术鉴定急性白血病患者和正常人血清中的自身抗体[D].中国人民解放军军事医学科学院,2006.