OGT抗体的应用

背景^[1-3]

OGT抗体是一种可以特异性结合OGT的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的OGT蛋白。OGT抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

OGT基因编码一种糖基转移酶，该酶催化在O-糖苷键中向丝氨酸或苏氨酸残基添加单个N-乙酰氨基葡萄糖。由于磷酸化和糖基化都竞争相似的丝氨酸或苏氨酸残基，因此这两个过程可能会竞争位点，或者它们可能会通过空间或静电效应改变附近位点的底物特异性。OGT蛋白质包含多个四肽重复序列，这些重复序列是识别底物所必需的。O-GlcNAc(O-linked N-acetylglucosamine)糖基化修饰是一种细胞内动态的蛋白质翻译后修饰。O-GlcNAc糖基转移酶(O-linked N-acetylglucosamine tra nsferase transferase,OGT)以UDP-GlcNAc作为供体底物,将单个N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine,GlcNAc)与蛋白质的丝氮酸或苏氨酸的羟基形成O-糖苷键,而这种修饰的去除是由糖苷酶(O-GlcNAcase,OGA)完成的。细胞内超过3000种蛋白具有O-GlcNAc修饰,O-GlcNAc修饰参与了细胞信号转导、配受体相互作用、病毒感染、转录调节、细胞分化、细胞应答以及蛋白质翻译与降解等生物过程。

OGT抗体

OGT抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（OGT抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(OGT抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

OGT抗体可以用于利用酿酒酵母构建OGT活性检测及新底物筛选体系

在酿酒酵母细胞中表达OGT的不同亚型,构建了OGT各亚型独立的研究体系;此外,鉴定了表达sOGT的酿酒酵母中O-GlcNAc修饰的内源蛋白,并对新发现的O-GlcNAc修饰蛋白进行了验证。

研究结果如下:(1)OGT三个蛋白亚型的主要差别是N端氨基酸序列的不同,我们的研究发现外源表达不同的OGT亚型对酿酒酵母生长抑制作用具有差异性,这些差异与OGT的N端氨基酸序列的不同组成密切相关;短OGT(short OGT,sOGT)对酿酒酵母的抑制作用依赖于其糖基转移酶的活性,而核质OGT(nuclear/cytoplasma OGT,ncOGT)和线粒体OGT(mitochondrial OGT,mOGT)的抑制作用不依赖于其催化活性;表达sOGT的酿酒酵母细胞可用于进行OGT的底物分析。(2)mOGT具有使其定位于线粒体内膜的N端基质导向序列(matrix targeting sequence,MTS)。在酿酒酵母中表达人源mOGT及其N端截短的突变体后,生长点板显示mOGT对酿酒酵母生长抑制作用依赖于其N端MTS序列;MTS序列的表达能引起酵母线粒体的融合,因此表达MTS序列的酿酒酵母有望成为哺乳动物细胞中mOGT过表达导致细胞凋亡的研究模型。(3)利用sWGA agarose对表达sOGT的酵母细胞中O-GlcNAc修饰的内源蛋白进行富集,并通过nanoLC-MS/MS鉴定到了468个O-GlcNAc修饰的酵母蛋白质,其中有13个被修饰的蛋白具有与其氨基酸序列一致性高于30%的人源蛋白,而且该人源蛋白的O-GlcNAc修饰状态在哺乳动物中尚未被报道。从中挑选了泛素结合酶2(ubiquitin-conjugating enzyme E2-16 kDa,Ubc5)、真核肽段释放因子的GTP结合亚基(eukaryotic peptide chain release factor of GTP-binding subunit,Sup35)、支链氨基酸转氨酶2(cytosolic branched-chain-amino-acid aminotransferase,Bat2)及组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase,Esa1)等蛋白与sOGT在酿酒酵母中共表达,通过OGT抗体蛋白质的免疫沉淀及抗O-GlcNAc的蛋白印迹实验发现Ubc5、Sup35、Bat2及Esa1均被O-GlcNAc修饰,从而验证了我们的O-GlcNAc修饰蛋白的富集及质谱分析方法是可信的。

参考文献

[1]RNA Aptamers Rescue Mitochondrial Dysfunction in a Yeast Model of Huntington’s Disease[J].Kinjal A.Patel;;Rajeev K.Chaudhary;;Ipsita Roy.Molecular Therapy-Nucleic Acids.2018

[2]A review of the role of chemical modification methods in contemporary mass spectrometry-based proteomics research[J].Alexander Leitner.Analytica Chimica Acta.2018

[3]A Conserved Splicing Silencer Dynamically Regulates O-GlcNAc Transferase Intron Retention and O-GlcNAc Homeostasis[J].Sung-Kyun Park;;Xiaorong Zhou;;Kathryn E.Pendleton;;Olga V.Hunter;;Jennifer J.Kohler;;Kathryn A.O’Donnell;;Nicholas K.Conrad.Cell Reports,2017(5)

[4]Yeast cells as an assay system for in vivo O-GlcNAc modification[J].Hideki Nakanishi;;Feng Li;;Baoxian Han;;Seisuke Arai;;Xiao-Dong Gao.BBA-General Subjects.2017

[5]李凤.利用酿酒酵母构建OGT活性检测及新底物筛选体系[D].江南大学,2020.