HLA-G抗体的应用

背景^[1-3]

HLA-G抗体是一种可以特异性结合HLA-G的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的HLA-G蛋白。HLA-G抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

HLA-G抗体

HLA-G抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（HLA-G抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(HLA-G抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

HLA-G抗体可以用于人类白细胞抗原G在子痫前期发病中的作用机制研究

人类白细胞抗原G(Human leucocyte antigen-G,HLA-G)是EVT表达的一种I类HLA分子,HLA-G通过与其免疫抑制性受体相互作用来介导免疫抑制。已知的HLA-G的免疫抑制性受体包括白细胞免疫球蛋白样受体B1(Leukocyte immunoglobulin-like subfamily B member 1,LILRB1)、白细胞免疫球蛋白样受体B2和KIR2DL4。这些受体由母胎界面的免疫细胞表达,其中蜕膜自然杀伤细胞(Decidual natural killer cells,d NK)是母胎界面最丰富的淋巴细胞群。

探讨HLA-G与d NK细胞上的抑制性受体LILRB1作用后对EVT侵袭产生的影响,并探究可能的分子机制,以期阐明HLA-G在PE的发病中的作用及机制。

方法:1.收取PE和正常妊娠晚孕期蜕膜组织各20例,采用HLA-G抗体免疫组化法和实时荧光定量PCR法检测PE蜕膜组织与正常妊娠蜕膜组织中HLA-G表达水平差异。2.收取早孕期蜕膜组织11例,采用流式细胞术从早孕期蜕膜组织中分选出d NK细胞;采用Transwell体系将分选出的d NK细胞与HTR-8/Svneo细胞共培养24h,按照干预方式和培养方式进行分组:(1)anti-LILRB1组:同时加入anti-LILRB1抗体和anti-HLA-G抗体;(2)anti-HLA-G组:只加入anti-HLA-G抗体;(3)HLA-G组:不使用抗体(anti-LILRB1抗体和anti-HLA-G抗体)干预;(4)d NK组:d NK细胞单独培养,此组作为对照。3.采用酶联免疫吸附法检测各组d NK细胞培养上清液中细胞因子表达差异;4.采用蛋白质免疫印迹法检测不同组别d NK细胞LILRB1表达差异;5.采用Transwell法检测与d NK细胞共培养24h后的各组HTR-8/Svneo细胞的侵袭能力。

HLA-G抗体结果:1.PE蜕膜组织中HLA-G表达水平显著低于正常妊娠蜕膜组织(P<0.001)。2.当LILRB1被抗体阻断时,d NK细胞表达Ang-2、GM-CSF、IFN-γ、IL-8、IP-10和VEGF-C水平显著降低;当HLA-G被抗体阻断时,d NK细胞表达Ang-2、GMCSF、IL-8、IP-10和VEGF-C水平明显降低,同时表达IFN-γ水平显著升高(P<0.05)。3.anti-HLA-G组表达LILRB1水平显著低于HLA-G组和d NK组(P<0.05)。4.anti-LILRB1组HTR-8/Svneo细胞侵袭能力显著弱于anti-HLA-G组和HLA-G组;HLA-G组HTR-8/Svneo细胞侵袭能力显著强于anti-LILRB1组和anti-HLA-G组;anti-HLA-G组HTR-8/Svneo细胞侵袭能力强于anti-LILRB1组弱于HLA-G组(P<0.0001)。结论:HLA-G在PE蜕膜中低表达。HLA-G可与d NK细胞上的抑制性受体LILRB1结合并上调d NK细胞上LILRB1的表达,HLA-G/LILRB1通路可调控d NK细胞表达相关细胞因子影响EVT侵袭。HLA-G低表达导致EVT侵袭能力减弱可能是PE发病的重要机制。

参考文献

[1]HLA-G and HLA-E Immune Checkpoints Are Widely Expressed in Ewing Sarcoma but Have Limited Functional Impact on the Effector Functions of Antigen-Specific CAR T Cells[J].Altvater Bianca;Kailayangiri Sareetha;Pérez Lanuza Lina F.;Urban Katja;Greune Lea;Flügge Maike;Meltzer Jutta;Farwick Nicole;K?nig Simone;G?rlich Dennis;Hartmann Wolfgang;Rossig Claudia.Cancers.2021

[2]Decidual Natural Killer Cells:A Good Nanny at the Maternal-Fetal Interface During Early Pregnancy[J].Liu Yuefang;Gao Shujun;Zhao Yangjing;Wang Hui;Pan Qiong;Shao Qixiang.Frontiers in Immunology.2021

[3]Maternal natural killer cells at the intersection between reproduction and mucosal immunity.[J].Shmeleva Evgeniya V;Colucci Francesco.Mucosal immunology.2021

[4]A possible role for HLA-G in development of uteroplacental acute atherosis in preeclampsia[J].Johnsen Guro M.;Fjeldstad Heidi E.S.;Drabbels Jos J.M.;Haasnoot Geert W.;Eikmans Michael;St?rvold Gro L.;Alnaes-Katjavivi Patji;Jacobsen Daniel P.;Scherjon Sicco A.;Redman Christopher W.G.;Claas Frans H.J.;Staff Anne Cathrine.Journal of Reproductive Immunology.2021

[5]孙丽娜.人类白细胞抗原G在子痫前期发病中的作用机制研究[D].山东中医药大学,2022.