T4RNALigase1的制备方法

背景及概述^[1]

连接酶是一种能催化两个不同或相同分子的两端相连接的酶，此反应与ATP分解反应相偶联。T4RNALigase（T4RNA连接酶）是以不依赖于模板的形式催化供体核酸的5'-磷酰基末端和受体核酸的3'-羟基末端形成磷酸二酯键。该酶活性依赖ATP，可作用于广泛的底物，包括RNA，DNA，寡核糖核酸、寡脱氧核糖核酸和很多其它核酸衍生物。T4RNALigase主要用于RNA5´末端加寡聚核酸用于映射和测序5´端，或用于cDNA合成(RACE)；用于3'-末端RNA标记；用于连接RNA和DNA；用于修饰突变RNA。

制备方法^[1]

T4RNALigase1可用于制备腺苷酰化接头，腺苷酰化接头能够被截短型的T4RNA连接酶2特异性识别，在没有ATP存在的条件下将腺苷酰化接头5’端有腺苷酰化修饰的磷酸与RNA的3’端的羟基连接，形成3,5-磷酸二酯键。

其制备方法包括：

(1)先合成一段寡核苷酸，寡核苷酸5’端磷酸化修饰，3’端进行氨基修饰、双脱氧胞嘧啶、磷酸修饰、荧光标记修饰、倒转碱基修饰或生物素标记修饰中的一种；

(2)将步骤(1)的寡核苷酸在非截短型的T4RNALigase1催化下与ATP反应，获得腺苷酰化接头。

本申请的制备方法，打破传统化学合成腺苷酰化接头的思维限制，先合成寡核苷酸，T4RNALigase1将ATP分解成AMP，AMP转移到磷酸上，形成腺苷酰化，由于3’端修饰，寡核苷酸保持在腺苷酰化中间态，从而制备出腺苷酰化接头。本申请的制备方法成本低、效率高，能满足使用需求，有效的降低了RNA高通量测序的成本。

参考资料

[1] CN201410391721.X一种制备腺苷酰化接头的方法及腺苷酰化接头