探针合成

背景^[1-6]

探针合成是克隆的DNA序列或通过PCR扩增获得的DNA。人工合成的寡核苷酸或从体外转录克隆的DNA序列后获得的RNA，也常作为探针。允许使用互补的配对碱基对靶核酸检测，但所用探针必须是单链。寡核苷酸和RNA探针是自然的单链分子，然而,DNA分子正常情况下是双链。在对靶序列杂交前，DNA分子必须变为单链，这一般是通过加热使其变性而达到解链目的。解链DNA分子被迅速冷却到只能缓慢复性的温度以下，可使探针保持单链状态。

靶DNA分子的检测要求用药物标记，以便观察杂交结果。探针一般用放射性同位素标记,如P32、S35、C14或H3.杂交体发出的射线，能使X光片感光而被观察到，这称为放射自显影。由于放射性物质的使用，对人体有风险，使得非放射性探针有了进一步的发展。常用地高辛(DIG)标记探针，它可被用染料标记或结合有能催化底物并形成有色产物的酶的特异性抗体检测到。

根据核酸分子探针的来源及其性质可分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针及人工合成的寡核苷酸探针等。

1. 基因组DNA探针

这类探针多采用分子克隆从基因文库筛选或用PCR技术扩增制备。由于真核生物基因组中存在高度重复序列，制备探针应尽可能选用基因的编码序列(外显子)，避免选用内含子及其他非编码序列，否则将引起非特异性杂交而出现假阳性结果。

2. cDNA探针

cDNA探针是以RNA为模板，在反转录酶的作用下合成的互补DNA，因此它不含有内含子及其他非编码序列，是一种较理想的核酸探针。cDNA探针包括双链cDNA探针和单链DNA探针。双链cDNA探针的制备方法是首先从细胞内分离出mRNA，然后通过逆转录合成cDNA，再通过DNA聚合酶合成双链cDNA分子。将双链cDNA分子插入载体中克隆、筛选、扩增、纯化，然后进行标记即可。

3. RNA探针

mRNA作为核酸分子杂交的探针是较为理想的，制备的RNA探针方法是，首先把目的基因cDNA片段插入到含有特异的RNA聚合酶启动子序列的质粒中，再将重组质粒扩增、纯化，用限制酶将质粒模板切割，使之线性化，然后在RNA酶的作用下，从启动子部位开始，以cDNA为模板进行体外转录。在体外转录反应体系中，只要提供有标记的核苷酸原料，经过体外转录后就能获得标记的RNA探针。

4. 寡核苷酸探针

采用人工合成的寡聚核苷酸片段作为分子杂交的探针，其优点是可根据需要随心所欲地合成相应的序列，避免了天然核酸探针中存在的高度重复序列所带来的不利影响；由于大多数寡核苷酸探针长度只有15～30bp，其中即使有一个碱基不配对也会显著影响其熔解温度(tm)，因此它特别适合于基因点突变分析；此外，由于序列的复杂性降低，因此杂交所需时间也较短。需要注意的是，短寡核苷酸探针所带的标记物较少，特别是非放射性标记时，其灵敏度较低，因此当用于单拷贝基因的Southern印迹杂交时，采用较长的探针为好。寡核苷酸探针是以核苷酸为原料，通过DNA合成仪合成的。合成寡核苷酸探针的长度一般为10～50个核苷酸。如果靶DNA或mRNA的序列是已知的，合成寡核苷酸的序列就很容易确定。

应用^[7][8]

探针合成可用于免疫组化和WB等实验：

基于荧光探针的生物成像技术所发挥的作用越来越大。随着生物成像等一系列技术的快速发展,荧光探针已然成为研究医学领域和生物学等相关难题的重要工具。目前,大部分研究都集中在特异性靶向定位及能够提供定量信息荧光探针的研究上。细胞核是细胞的控制枢纽,它在细胞的代谢、生长、分化等过程中起着不可取代的作用。

目前具有特异的靶向定位到细胞核内的荧光探针还是很少,因此开发出具有特定功能的细胞核靶向探针非常重要。以Hoechst和萘酰亚胺为两个荧光团为母体,通过’Click’反应,得到一个Hoechst和萘酰亚胺的二联体Hoe-N1。探针Hoe-N1具有两个发射峰,能够比率检测DNA的浓度,并且可以比率检测羟基自由基对DNA的损伤。

细胞成像发现,探针Hoe-N1能够特异性定位到我们实验所用的所有细胞系的细胞核内,包括L02,SMMC-7721,COS-7,MCF-7,Hela,raw 246.7等细胞,并且具有非常低的背景荧光。最重要的是,探针Hoe-N1是目前发现的个用比率检测活细胞细胞核内双链DNA的浓度的探针,并且可以用来监测活细胞内由羟基自由基引起的双链DNA的损伤。

参考文献

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