人外周血树突状细胞的分离、培养

背景及概述^[1-2]

树突状细胞作为专职性的抗原呈递细胞，通过直接激活并调控T淋巴细胞的免疫功能，对机体免疫反应发挥重要的调节作用，因此在肿瘤免疫治疗和研究中的地位受到广泛的重视。树突状细胞可以来源于外周血和脐带血的单核细胞，也可以从骨髓液的前体细胞分化而来，在不同的发育阶段具有不同的表型特征和生理功能，由于人外周血的取材较为方便，因此从正常人的外周血中分离出单个核细胞，并在含有重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子与重组人白细胞介素的RPMI1640完全培养基中进行体外培养，进一步研究了人外周血树突状细胞在增殖、分化成熟过程中的形态学及功能方面的变化，为进一步研究树突状细胞瘤苗在肿瘤免疫治疗中的应用打下了基础。

分离、培养^[2]

1. 人外周血树突状细胞的分离、培养

1）人外周血树突状细胞的分离培养：抽取正常健康人(经免疫学检验人类白细胞抗原A2表达阳性)的抗凝外周全血。知情同意。用RPMI1640溶液进行2倍稀

释，经淋巴细胞分离液密度梯度离心(1800r/min，15min)，轻轻吸取灰白色层的界面细胞，置于15mL离心管中，用RPMI1640溶液悬浮细胞并离心(1000r/min，5min)洗涤2次，用含10%人AB血清的RPMI1640完全培养基悬浮细胞，调整细胞浓度至1×109L-1，加入6孔培养板中，于37℃及体积分数为0.05的CO2培养箱中孵育5h，细胞贴壁后吸弃上清，用RPMI1640培养液轻轻洗涤2次去除非贴壁细胞，重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子与重组人白细胞介素4(终浓度均1000U/mL)的RPMI1640完全培养基，继续在37℃及体积分数为0.05的CO2培养箱中孵育；分别于隔天进行半量换液，并加入含重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子与重组人白细胞介素4(终浓度均为1000U/mL)的RPMI1640完全培养基，继续培养至第6天，收获树突状细胞。应用流式细胞仪进行了树突状细胞表面表型的检测和分析。

2）人外周血树突细胞的得率与纯度：分别取经过以上细胞因子诱导培养后第1，3，6天的树突状细胞，在倒置相差显微镜下观察，并按下列式子进行树突状细胞得率与纯度的计算：树突状细胞得率=第n天收获的树突状细胞数量/第1天孵育的单个核细胞总数×100%树突状细胞纯度=第n天收获的树突状细胞数量/(第n天收获的树突状细胞数量+单个核细胞数)×100%。

3）人外周血树突状细胞表面表型检测：分别在培养的第1，6天收集树突状细胞并制成单细胞(轻轻吹打并用细胞刮刀轻轻刮取贴壁部分的细胞)并制成单细胞悬液，计数1×109L-1，用PBS悬浮并离心(250g，5min)洗涤2次去除上清，调整细胞密度至1×109L-1，各测量管加入细胞悬液500μL，再分别加入用PE或FITC标记的CD1a、HLA-DR、CD80、CD83和CD86抗体，置4℃避光反应标记40min，PB洗2次，免疫染色后的细胞悬于含有0.5%多聚甲醛的PBS细胞固定液中。24h内上机流式细胞仪进行树突状细胞表型分析。同种混合淋巴细胞反应：抽取与以上树突状细胞不同来源的其他健康人外周血，经淋巴细胞分离液分离后(知情同意)，取界面细胞于37℃及体积分数为0.05的CO2培养箱中孵育5h，获取非贴壁细胞，用含10%人AB血清的1640培养基重悬，加入IL-2(500U/mL)在37℃及体积分数为CO2培养箱中继续孵育6d，作为同种异体T淋巴细胞；树突状细胞则分为两组，一组按上述常规方法培养6d，另一组在培养至第5天时加入黑色素瘤抗原基因A3编码的多肽(终浓度为50mg/L)继续培养24h；在经紫外线处理后的96孔板中，分别加入树突状细胞悬液1×104，5×103，2×103，1×103/孔，以自身T淋巴细胞作为对照，每孔设3个复孔，分别加入1×105/孔，即配成树突状细胞∶T细胞分别为1∶10，1∶20，1∶50，1∶100的比例，终体积为200μL，在37℃及体积分数为0.05的CO2培养箱中孵育90h后，每孔加入5g/L的MTT10μL，6h后每孔加入0.04mol/L的DMSO100μL终止反应，静止5min后在酶标仪上测570nm波长的OD值。刺激指数(SI)=实验孔OD平均值/对照孔OD平均值。以此评价树突状细胞刺激T淋巴细胞增殖的能力。

4）电镜分析：人外周血树突状细胞悬液(1×109L-1)用PBS洗2次，4%戊二醛固定后，PBS洗1次，制成悬液，梯度酒精脱水，用1∶1的纯乙醇和叔丁醇浸透1h，真空干燥、喷金，扫描电镜观察摄片。主要观察指标：①树突状细胞扩增效率和表型变化。②观察混合淋巴细胞反应的强度变化。

2.结果

1）人外周血树突状细胞体外培养形态：分离人外周血单个核细胞，加细胞因子培养后第1天，在高倍倒置显微镜下观察，可见贴壁细胞聚集现象(图1a)，体积较小，绝大多数为圆形，仅有少量的半悬浮细胞，随后悬浮细胞开始逐渐增加，体积也逐渐变大，形状变得不规则；继续培养至第6天，细胞体积明显变大，约为单个核细胞的三四倍，大部分细胞发生脱壁、悬浮，可见伸展的毛刺状突起，为典型的树突状细胞形态，其中混杂有少量的单个核细胞(图1b)。

2）人外周血树突状细胞的扩增效率及表型检测：培养不同时期的树突状细胞在倒置显微镜下观察，高倍镜下计数形态典型的树突状细胞和单个核细胞，发现树突状细胞的得率从第1天的2.1%增至第6天的16.3%，收获的树突状细胞纯度从第1天的10.3%升至第6天的90.81%(图2)。并分别于第1和第6天进行了流式细胞仪的检测，发现与树突状细胞相关的CD1a、HLA-DR、CD80、CD83、CD86逐渐增高，从第1天的2.3%、46.2%、18.4%、8.36%、19.8%，升高至第6天的21.8%、99.0%、63.4%、18.9%、80.6%(图3)。

3）扫描电镜观察：树突状细胞的超微结构取培养第6天的树突状细胞进行电镜观察，可见树突状细胞的表面较为粗糙，形态呈不规则状，并有大量的皱折和不规则的突起，与单核巨噬细胞表面的小棘状突起明显不同。

4）同种混合淋巴细胞反应：将来源于表达人类白细胞抗原A2的外周血单核细胞，经诱导培养6天获得的两组树突状细胞作为刺激细胞，以不同浓度与同种

异体淋巴细胞混合，均可产生增殖反应；结果显示，经过黑色素瘤抗原基因A3编码的多肽抗原处理的各种比例的树突状细胞，较相应未经黑色素瘤抗原基因A3编码的多肽抗原处理的树突状细胞，激发淋巴细胞增殖的能力明显增强，最明显的刺激效果发生在树突状细胞浓度相对较高的比例，证实制备的树突状细胞具有较强的抗原呈递功能。

主要参考资料

[1] 儿科学辞典

[2] 人外周血树突状细胞的分离与鉴定