大鼠胚胎成纤维细胞的培养

背景及概述^[1-2]

成纤维细胞是疏松结缔组织中最常见而且数量较多的一种细胞，位于胶原纤维近旁并依附于其上。此细胞的形态结构可随其功能状态的不同而改变。在功能活动旺盛时，成纤维细胞的胞体较大，呈扁平星形，有突起。胞核呈卵圆形，核染色质较少，着色浅，核仁明显。胞质较多，弱硷性，内含丰富的粗面内质网、核蛋白体、高尔基复合体以及微丝和微管等结构，表明此种细胞具有合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白和多糖蛋白，形成胶原纤维、弹性纤维、网状纤维和基质的作用。在相对静止或功能活动不活跃时的细胞，称为纤维细胞。这种细胞比成纤维细胞小，轮廓不甚清楚，多呈梭形。胞质少，弱嗜酸性，其中粗面内质网、高尔基复合体及其它细胞器均不发达。这表明纤维细胞是功能活动不活跃的细胞。但在一定条件下，如创伤修复，结缔组织再生时，纤维细胞可转化为功能活跃的成纤维细胞，积极参与合成和分泌蛋白质，形成纤维和基质。　胚胎成纤维细胞饲养层是体外成功培养人胚胎干细胞(ES)细胞的必要条件。主要分泌某些细胞因子如成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子，以促进ES细胞增殖以及抑制分化。同时又能分泌细胞外基质，如纤维连接蛋白(FN)、层黏连蛋白(LN)等。胰岛细胞从它们自然的细胞外基质中分离出来将可能经历一种奇特的凋亡死亡过程。为分离的胰岛移植前提供合适的微环境，许多学者采用小肠粘膜细胞、肝细胞、垂体前叶细胞、Sertoli细胞与胰岛共同培养均可使“目的细胞”的存活和功能情况明显改善。有研究对影响大鼠胚胎成纤维细胞分离和培养的一些因素和方法进行探索，建立稳定的大鼠胚胎成纤维细胞培养体系。

培养^[2]

1. 原代大鼠胚胎成纤维细胞的制备

将性成熟雌鼠(6～8周龄)与雄鼠(8周龄)按2∶1比例合笼，每天早上观察雌鼠阴道口，有乳白色或淡黄色胶冻状物(阴道栓)者即认定为怀孕0.5d。取妊娠10.5～18.5d的孕鼠，制备上清液。重复其消化过程，直至上清澄清为止。合并各次上清，1000r/min离心5min，弃上清，以完全培养液吹吸悬浮沉淀成单细胞悬液，加入75cm2培养瓶，37℃，5%CO2培养。

2. 台盼兰排斥实验检测原代大鼠胚胎成纤维细胞细胞存活率

将大鼠胚胎成纤维细胞s单细胞悬液细胞密度调整为106细胞/mL。取9滴细胞悬液滴到载波片上，加1滴0.4%的台盼兰溶液，混匀。3min之内用血球计数板分别记数活细胞数和死细胞数(注：镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染)。根据公式：活细胞率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100。

3. 二代大鼠胚胎成纤维细胞培养　

原代大鼠胚胎成纤维细胞生长铺满培养瓶后消化传代，消化液为0.25%胰酶，在显微镜下观察消化过程，见细胞变圆后立即以完全培养液(含10%FBS、100U/mL青霉素和80U/mL链霉素的DMEM低糖培养液)终止消化。

4. 细胞的冻存与复苏　

冻存液为1份二甲基亚砜(DMSO)与9份完全培养液混合，冻存与复苏按常规进行。

3. 细胞生长曲线测定

①将接种前的一部分均匀大鼠胚胎成纤维细胞单细胞悬液接种于96孔板，每孔加样200μL，接种9排，每排5孔，测定1排/d；②将96孔板置于37℃孵箱里培养1d；③培养终止前4h向所测排的每孔加入MTT20μL；④置于37℃孵箱继续培养4h；⑤4h后吸去上清，加入150μLDMSO终止；⑥将96孔板置于酶标仪上，490nm测定吸光度。

4. 大鼠胚胎成纤维细胞细胞爬片

将P0、P1、P2、P3代大鼠胚胎成纤维细胞接种后留少许均匀大鼠胚胎成纤维细胞单细胞悬液接种于铺有盖玻片的6孔板，每孔加样2～3mL(铺满每孔底部即可)。37℃孵箱培养1～2d。盖玻片上细胞密度适中，可以终止培养。细胞爬片用PBS清洗3次；95%的酒精固定15min。PBS清洗3次。晾干后以中性树胶将无细胞侧贴于载玻片，待用。

5. 爬片染色

固定后的爬片以蒸馏水洗涤，PBS洗3次。常规HE染色：苏木素中染色2～5min。流水清洗，1%盐酸溶液分色。1%氨水蓝化；流动自来水清洗爬片3次。0.5%伊红水溶液中1～5min。爬片进入蒸馏水中清洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明。中性树胶封片。免疫细胞化学染色按试剂盒说明书进行，苏木精复染细胞核。阴性对照略去一抗其余步骤不变。

8.结果

1）细胞生长曲线

由图1可见第3代大鼠胚胎成纤维细胞在培养至第3d时进入对数生长期，细胞快速增加，至6d时细胞数达高峰，未经明显的平台期，便进入衰退期，细胞数量下降，可见有细胞漂浮。

2）生长形态观察

胚胎组织经胰酶消化解聚后呈球形。大鼠胚胎成纤维细胞在体外为贴壁生长型细胞，大小不均，异质性较大，原代培养约4～12h开始贴壁，胞质向外伸出伪足而形成梭形、多边形或不规则异形等形状，中间有卵圆形核。原代大鼠胚胎成纤维细胞细胞中有时杂细胞较多，可能混杂有上皮样等细胞(图2)。传两代后(P3)细胞才较纯，第五代(P5)以后，细胞开始老化。可见细胞伪足增多，并有分叉，细胞内颗粒增多，细胞之间空隙较大(图3、4)。

3）原代消化后细胞存活率　

台盼兰染色后计细胞总数共1800个，其中着色细胞(死细胞)106个，未着色细胞(活细胞)1694个，细胞存活率94.11%。

4）胚胎日龄胎鼠对大鼠胚胎成纤维细胞的影响

10.5d、13.5d、18.5d龄小鼠胚胎均可分离得到成纤维细胞，但10.5d鼠胚太小，不利操作，分离所得细胞数量少；18.5d鼠胚有骨细胞的混杂，分离所得成纤维细胞中杂细胞较多，且易老化；13.5d胎鼠分离所得细胞数量多，杂细胞较18.5d胎鼠少，细胞增殖能力强。

5）冻存对大鼠胚胎成纤维细胞的影响

对冻存的P1和P2代细胞复苏后的培养情况观察发现P1代细胞复苏后形态要优于P2代，且复苏细胞传代后与未经冻存的细胞相似，不影响其活性和功能。

6）爬片染色结果

大鼠胚胎成纤维细胞经HE染色后细胞呈梭形或多边形。染为粉红色。核圆或椭圆形居中，着紫蓝色，核仁明显。免疫细胞化学结果显示：原代大鼠胚胎成纤维细胞中绝大部分细胞vimentin和fibrinectin免疫反应阳性，有少部细胞呈ck18阳性。免疫反应产物位于胞质，呈棕黄色颗粒或纤维状。细胞核呈篮色居中，核仁明显。

主要参考资料

[1] 运动解剖学、运动医学大辞典

[2] 大鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及生物学特性