大鼠骨髓内皮祖细胞（EPC）的培养

背景及概述^[1-2]

1997年证实循环细胞具有分化为成熟内皮细胞并参与新血管形成的潜能，这种细胞被命名为内皮祖细胞。研究发现，内皮祖细胞主要存在于骨髓、脐血和外周血，但是少量的内皮祖细胞也被发现存在于脂肪组织、脾脏、心脏、血管、骨骼肌部位。在组织缺血部位，内皮祖细胞参与血管的新生。最近的证据表明心血管功能和血管发生受到起源于骨髓的循环的未成熟细胞的显著调节，增加血管发生，提高血管修复和改善内皮功能。外周血中所含内皮祖细胞极低，因此选用骨髓来分离内皮祖细胞。采用免疫磁珠法虽然获得的细胞纯度较高，但是操作复杂，费用昂贵，因此目前已较少采用。因此，在心肌梗死、动脉粥样硬化、糖尿病周围血管病变等缺血性疾病中，内皮祖细胞有广泛的应用前景。但内皮祖细胞的分离、培养及鉴定方法目前并不统一。有研究探索了大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养及鉴定方法。

培养^[1-2]

大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养与鉴定

1 培养分离方法：

1）单个核细胞的分离：SD大鼠脱臼处死，无菌条件下取胫骨及股骨，冲洗骨髓并吹打直至变为单细胞悬液。将细胞悬液小心加至等体积大鼠淋巴细胞分离液之液面上，2000r/min离心20min，用吸管吸取单个核细胞层洗涤细胞3次。收集到的细胞为单个核细胞。

2）大鼠骨髓内皮祖细胞（EPC）的培养：用体积分数10%胎牛血清的EBM-2调整单个核细胞浓度为(2.5~5)×109L-1，接种于包被了25μg人纤维连接蛋白的T25瓶中。48h后首次换液，将悬浮细胞重新在37℃、体积分数5%CO2、饱和湿度下培养。72h后换液。以后每隔2d换液1次。

3）大鼠骨髓内皮祖细胞（EPC）生长曲线的绘制：取培养第7天的内皮祖细胞，用新鲜培养基将细胞调整为1×108L-1，接种于96孔板，每孔加细胞悬液100μL，共接种42个孔。另选14个孔加入100μL不含细胞的培养基。使用法测细胞生长曲线连续测量14d。以培养时间为横轴，吸光值为纵轴，绘制生长曲线。

4）大鼠骨髓内皮祖细胞（EPC）的鉴定：流式细胞仪检测：取新分离的单个核细胞、培养10，16，20d的细胞分别加入FITC标记的抗大鼠CD133，PE标记的抗大鼠CD34各2μL，送流式中心上机检测。空白对照加入FITC和PE标记的同型对照抗体。

5）双荧光染色鉴定：取培养第7天的细胞，用PBS洗2遍，加入用完全培养基稀释的10mg/L的Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白1mL，于培养箱中孵育4h。用PBS洗3次。用40g/L多聚甲醛固定20min。加入用PBS稀释的10mg/L的FITC标记的荆豆凝集素11mL，孵育1h。以不加Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素1的细胞做阴性对照。于激光共聚焦显微镜下观察，拍照。主要观察指标：细胞形态、数量以及标志蛋白的鉴定。

2. 结果

1）大鼠骨髓内皮祖细胞（EPC）形态学观察。

新分离的内皮祖细胞为圆形，大小不一。培养2d后可见部分细胞贴壁变形。2次贴壁的细胞于培养3d内贴壁，刚开始为圆形，逐渐变大、伸出伪足，变为梭形、纺锤形、多角形，以梭形细胞为主。培养前4d细胞增殖不明显，第5~10天迅速增殖，并可见细胞集落及线状结构形成，第10天可达80%融合。细胞集落中心为圆形细胞，周围为梭形，呈放射状。10d以后细胞增殖缓慢。第14~16天，大部分细胞呈多角形，可呈微血管样生长，细胞成典型铺路石样。细胞融合至80%时，以1∶2消化传代。

2）内皮祖细胞的生长曲线：MTT法测定细胞生长曲线结果显示：细胞生长潜伏期一般为1~4d，培养后第5~10天达对数生长期，第11~14天进入生长平台期，表明体外培养的大鼠骨髓内皮祖细胞（EPC）生长增殖旺盛，生物学性能稳定，见图2。

3）流式细胞仪鉴定：大鼠骨髓内皮祖细胞（EPC）的结果新分离的骨髓单个核细胞中，CD133+细胞占4.2%，CD34+细胞占2.5%，CD34+/CD133+细胞占2.1%。体外培养10d后，CD133+细胞占19.2%，CD34+细胞占28.7%，CD34+/CD133+细胞占19.1%。体外培养16d后，CD133+细胞占7.4%，CD34+细胞占17.2%，CD34+/CD133+细胞占7.3%。体外培养第20天，CD133+细胞占2.7%，CD34+细胞占4.3%，CD34+/CD133+细胞占1.9%。

4）双荧光染色鉴定：大鼠骨髓内皮祖细胞（EPC）的结果内皮祖细胞具有吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素1的功能，当内皮祖细胞吞噬了Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白后，在激光共聚焦显微镜下可见红色荧光，当内皮祖细胞吞噬了FITC标记的荆豆凝集素1后，可见绿色荧光。正在分化的内皮祖细胞既可吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白，又可吞噬FITC标记的荆豆凝集素1，在激光共聚焦显微镜下表现为黄色荧光。表现为黄色荧光的细胞为正在分化的大鼠骨髓内皮祖细胞（EPC）。

相关研究

有氧运动对中老年大鼠骨髓内皮祖细胞增殖能力的影响有研究探讨有氧运动对中老年大鼠骨髓来源内皮祖细胞增殖能力的影响。方法：健康中年雄性SD大鼠12只，按体重随机分为两组，即空白对照组和有氧运动组。采用乳酸阈测定法和递增负荷跑台训练建立有氧运动模型，每周训练6天，为期16周。方案结束后12h提取大鼠骨髓，运用密度梯度离心法分离得到单个核细胞，以EGM-2培养诱导其分化获取内皮祖细胞，通过双荧光染色法观察细胞对乙酰化低密度脂蛋白的摄取和与荆豆凝集素1的结合，并结合形态学特征鉴定内皮祖细胞。倒置显微镜下计数贴壁细胞数量和计算集落形成率以反映细胞增殖情况。结果：各组贴壁细胞数量第7d多于第48h(P<0.01)；与对照组相比，有氧运动组贴壁细胞数量明显增加(P<0.01)，且集落形成率大(P<0.01)。结论：有氧运动能促进中老年大鼠骨髓来源的内皮祖细胞增殖。

此外，还有实验观察外源性糖化碱性成纤维细胞生长因子-2(gFGF-2)对大鼠骨髓内皮祖细胞(EPCs)数量及体外生物学活性的影响。方法将10μg/mlFGF-2同250mmol/L浓度的D-果糖于37℃共同培养48h制备gFGF-2，用蛋白指纹图谱分析仪检测其糖化情况。密度梯度离心法获取大鼠骨髓单个核细胞，培养4d后，分组分别用FGF-2(150μg/ml)、gFGF-2(150μg/ml)继续干预培养3d。用免疫组织化学和免疫荧光染色作CD34、CD133、VEGFR-2、ac-LDL和UEA-1检测来鉴定EPC。胰酶消化培养7d的贴壁细胞，将细胞分别同FGF-2和gFGF-2于37℃下培养72h，用血管生成试剂盒检测其能力。收集培养7d的细胞，贴壁细胞作EPCs附能力测定；用改良的Boyden小室作EPCs迁移能力测定；MTT法测定EPCs增殖能力；用放射性免疫法测定细胞的培养液GM-CSF，EPO和IL-8的含量。结果经蛋白指纹图谱分析鉴定FGF-2成功糖化成gFGF-2。EPCs体外功能测定表明gFGF-2组骨髓EPCs比FGF-2组明显的黏附能力降低(P<0.05)，迁移能力降低(P<0.01)，增殖能力减弱(P<0.05)，成血管能力降低(P<0.01)；EPC分泌的EPO(P<0.05)、GM-CSF和IL-8(P<0.01)比对照组都减少(P<0.01)。结论EPC在gFGF-2的作用下数量减少且体外生物学活性降低，并且血管新生能力也减弱，推断gFGF-2可能是糖尿病患者体内血管新生功能降低的原因之一。

主要参考资料

[1] 大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养与鉴定

[2] 有氧运动对中老年大鼠骨髓内皮祖细胞增殖能力的影响

[3] 外源性gFGF-2对大鼠骨髓内皮祖细胞体外生物学活性的影响研究