F12K液体培养基的应用

背景及概述^[1]

F12K液体培养基可用于细胞培养。保存条件：2-8°C，一年有效。产品成分：含1260 mg/L D-葡萄糖，292mg/L L-谷氨酰胺，220mg/L丙酮酸钠，2500mg/L碳酸氢钠，pH值7.2-7.4。

使用说明^[1]

培养基长期放置，需要2-8度避光保存，请勿低温冻存。

其中添加的L-谷氨酰胺会有一定的半衰，长期放置后使用发现细胞生长变慢请添加L-谷氨酰胺，来维持细胞的正常代谢。

如果多人使用，建议分装成100ml或 250ml的规格，以防止使用过程中交叉污染。

含有一定量的NaHCO₃的培养基暴露在空气中 PH值会上升，培养基的颜色会由桃红变微紫，可使用Hepes盐调节到正常PH范围再进行细胞培养。

应用^[2-3]

一、用于制备一种甄别霍乱毒素的细胞学检测试剂盒。

在霍乱弧菌疫情的防控工作中，菌体是否产生CT是一个极为重要的检测指标。目前，传统的CT检测方法主要依靠动物实验，传统细胞学、免疫学、分子生物学和生物传感器等技术，但是这些方法检测周期长，灵敏度低，而且无法针对霍乱毒素的活性进行有效甄别。因此，有必要建立一种能够实时动态、高灵敏度的霍乱毒素检测方法。CN201210014246.5提供一种甄别霍乱毒素的细胞学检测试剂盒，主要包括：Y1肾上腺皮质细胞(本发明中为市购，ATCC：CCL‑79)，抗霍乱毒素中和抗体，多聚 赖氨酸，96‑E‑plate，以及用于Y1肾上腺皮质细胞的细胞培养基。所述细胞培养基可为常规适用于Y1肾上腺皮质细胞的培养基，本发明中所述细胞培养基组成如下：马血清15％(v/v)，胎牛血清2.5％(v/v)， 溶剂为F‑12K液体培养基。

二、用于一种组胺H1受体拮抗剂的筛选方法

本发明涉及一种组胺H1受体拮抗剂的筛选方法，本发明通过采用无标记细 胞靶点药理学技术监测组胺作用于A-431细胞或A-549细胞后引起的DMR响应 信号，再次以组胺作用于A-431细胞或A-549细胞后引起的DMR响应信号呈剂 量依赖性脱敏，证明A-431细胞或A-549细胞上高表达H1受体，且受体激动后 引起的DMR响应信号可成功被监测。以特异性组胺H1受体拮抗剂预处理A-431 细胞或A-549细胞不引起DMR响应信号，但再次加入组胺后组胺的DMR响应信号被剂量依赖性地拮抗。

由此成功建立组胺H1受体拮抗剂筛选方法：首先监测待筛选化合物预处理A-431细胞或A-549细胞所引起的DMR响应信号，如果待筛选化合物不引起DMR响应信号，而再次加入组胺后组胺的DMR响应信号被拮抗，根据响应信号被拮抗程度判断化合物对H1受体的拮抗活性。本发明通过监测H受体激动剂组胺作用于A-431细胞或A-549细胞后引起的 DMR响应信号，发现组胺在A-431细胞或A-549细胞上能够引起DMR响应信号，且呈剂量依赖性；以不同浓度的组胺预处理A-431细胞或A-549细胞后，再次加入固定浓度的组胺，监测所引起的DMR响应信号，发现预处理时组胺的浓度越高 第二步加入组胺所引起的DMR响应信号被脱敏越明显，呈剂量依赖性。

阿司咪唑、氯雷他定为特异性组胺H1受体拮抗剂，以不同浓度的阿司咪唑或氯雷他定预处理A-431细胞或A-549细胞后，再次加入固定浓度的组胺，监测所引起的DMR响应信号，发现阿司咪唑和氯雷他定分别剂量依赖性地拮抗组胺所引起的DMR响应信号。组胺H1受体在A-431细胞和A-549细胞中表达，因此上述结果提示，采用无 标记细胞靶点药理学技术可以成功监测A-431细胞或A-549细胞上H1受体被组胺 激动所引起的DMR响应信号及组胺受体激动剂或拮抗剂预处理后引起组胺脱敏 或拮抗的DMR响应信号。由此成功建立组胺H1受体拮抗剂筛选方法：首先监测待筛选化合物预处理 A-431细胞或A-549细胞后所引起的DMR响应信号，如果待筛选化合物不引起DMR 响应信号，则继续加入组胺，监测组胺所引起的DMR响应信号是否被拮抗，判 断化合物对组胺H1受体的拮抗活性。本发明所述的A-431细胞是指人表皮癌细胞；本发明所述的A-549细胞是指人非小细胞肺癌细胞。所述组胺H1受体拮抗剂筛选方法包括如下步骤，

A.细胞培养：

A-431细胞用含有10％的胎牛血清、100U/ml氨苄青霉素、100μg/ml硫酸链 霉素的DMEM培养基，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养；

A-549细胞用含有10％的胎牛血清、100U/ml氨苄青霉素、100μg/ml硫酸链霉素的F12K液体培养基，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养；

B.收获步骤A所培养的A-431细胞或A-549细胞，接种到384孔生物感应器 微型板中，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养24～48h；

C.步骤B培养的A-431细胞继续用不含胎牛血清的培养基饥饿处理16～24 h，步骤B培养的A-549细胞不需饥饿处理；

D.步骤C培养的细胞用HBSS缓冲液洗2次，再加入HBSS缓冲液，置于高通 量、无标记筛选系统上平衡孵育1～2h；

E.平衡后首先在高通量、无标记筛选系统上建立一个2min的基线，然后 加入10μL所述待筛选化合物，继续监测0.5～1h，然后加入10μL的组胺继续 监测0.5～1h；

F.以化合物预处理剂量与组胺引起的DMR响应绘制量效关系曲线、计 算所述待筛选化合物的IC50值，比较所述待筛选化合物对组胺H1受体的拮抗活性。

步骤B中A-431细胞或A-549细胞的接种密度为2×10⁴～2.5×10⁴个/孔。

本发明与其他组胺H1受体拮抗剂筛选方法相比，优点和有益效果为：

本发明采用无标记细胞靶点药理学技术，通过监测探针分子/药物作用于活细胞后引发细胞内部物质动态的变化过程来进行组胺H1受体拮抗剂的筛选，与其他组胺H1受体拮抗剂筛选方法相比，无标记细胞靶点药理学方法具有高通量 (可以采用384孔生物感应器微型板测定)、高内涵(能反映药物作用的多维属性)、高灵敏(可以监测到药物在nM浓度下引起的响应信号)的特性，反映的是药物分子刺激细胞引发配体结合、受体激活、蛋白募集、受体内化等而引起的活细胞内部动态的物质再分布(dynamic mass redistribution,DMR)，分析的是多信号通路的综合效应而非孤立的单信号转导。本发明所建立的方法不仅可以进行组胺H1受体拮抗剂的筛选，还能在靶标特异性、有效性和作用模式(即激动作用、拮抗作用或反向激动作用)方面进行分子的药理学定性。

主要参考资料

[1] F12K液体培养基说明书

[2] CN201210014246.5 一种甄别霍乱毒素的细胞学检测试剂盒及检测方法

[3] CN201510616778.X 一种组胺H1受体拮抗剂的筛选方法