Tte uvrD解旋酶的相关研究

背景及概述^[1]

紫外线修复酶 UvrA，UvrB， UvrC 和 UvrD 系统，是紫外线引起 DNA 损伤的主要修复酶，它能对紫外线 引起的 DNA 损伤启动剪切 性修复。这种 DNA 修复方式不需要光的参与，因此也被称为“暗”修复。在细菌体内，核苷酸切除修复需要 UvrA， UvrB 和 UvrC 蛋白来启动 CPD 和 6-4 光产物的修复，以及其 它方式 DNA 损伤的修复。Tte uvrD解旋酶也被称为解 旋酶Ⅱ，作为 SF1 总家族成员之一，是由 720 个氨基酸 组成的分子质量为 82 ku 的蛋白质，在氨基酸序列上， 与 Rep 蛋白具有近 40%的相似性。UvrD 蛋白的二聚体 形式被认为是能与 DNA 稳定结合的形式，且二聚体形 式被视为解旋的有效形式。由于 UvrD 蛋白本身具有 解旋酶 3’端→5’端解旋的活性，在较高酶浓度的情况 下，它可以启动单链 DNA 的部分、缺口 DNA 或平端 DNA 的解旋。

相关研究^[2]

有研究以腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)基因组DNA为模版，通过PCR克隆编码Tte uvrD解旋酶的基因tte-uvrd，将该基因插入原核表达载体pET-32a(+)，构建重组表达载体pET-32a(+)-tte-uvrd，转入E.coli BL21中，经蓝白斑筛选和双酶切法筛选阳性重组转化子，挑取测序正确的单个阳性菌落，在IPTG诱导下表达出重组蛋白Tte-uvrD。诱导后的菌体经超声破碎和离心，上清液用硫酸铵沉淀法初步纯化，透析除盐，冻干复溶后得到粗酶液。用tHDA反应来验证Tte uvrD解旋酶粗酶液的活性，比较不同储存温度下粗酶液酶活保持的时间，并比较-20℃下储存两个月的粗酶液与商品化纯酶的tHDA反应灵敏度。结果表明，用本研究建立的克隆方法可成功克隆出耐热Tte uvrD解旋酶，其粗酶液能用于tHDA反应，说明粗酶液具有解旋活性；粗酶液在-20℃下第80d酶活仍能保持稳定，4℃下则只能保持酶活约一周；-20℃下储存两个月的粗酶液能达到与商品化纯酶相当的灵敏度。

主要参考资料

[1] 紫外辐射引起DNA损伤的修复

[2] 腾冲嗜热厌氧菌耐热解旋酶Tte-uvrD的克隆表达及粗酶的初步应用