人淋巴毒素Β(LTB)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人淋巴毒素Β(LTB)ELISA KIT是一种用于检测人血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中淋巴毒素Β（LTB）含量的试剂盒。它基于酶联免疫吸附法（ELISA）的原理，通过特定的抗体与样本中的LTB结合，进而通过一系列反应产生可测量的信号，从而实现对LTB的定量检测。

人淋巴毒素Β（LTB）是一种由激活的淋巴细胞产生的细胞因子，属于肿瘤坏死因子（TNF）家族成员。它具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒和诱导分化等多种生物学功能。LTB在淋巴组织的正常发育和炎症反应中发挥重要作用。

使用人淋巴毒素Β（LTB）ELISA Kit时，需要严格按照说明书进行操作，包括样本的准备、加样、孵育、洗涤、显色和读数等步骤。同时，需要注意一些实验细节，如酶标包被板的保存、标准品和样本的稀释、显色时间的控制等，以确保实验结果的准确性和可靠性。

人淋巴毒素Β(LTB)ELISA KIT

人淋巴毒素Β(LTB)ELISA KIT操作步骤：

实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μl（在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6.依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后立即进行检测。

应用^[4][5]

人淋巴毒素Β(LTB)ELISA KIT可以用于猪淋巴毒素β受体基因的克隆及其在IPEC-J2细胞中的功能研究

由肠道免疫力低下导致的仔猪在断奶期死亡给养猪业带来巨大损失。肠道免疫系统是由免疫细胞、免疫球蛋白A(IgA)和肠道微生物组成。已有研究表明TNF家族成员之一,淋巴毒素β受体(Lymphotoxinβreceptor)通过对机体IgA的调控在肠道免疫中起关键作用。研究表明,淋巴毒素β受体基因(LTβR)敲除小鼠体内缺少淋巴组织,IgA含量下降,细菌感染后死亡率增高;相反,LTβR信号通路激活能发挥抗细菌感染的作用,同时也能改变肠道菌群的组成。基于这些研究结果,我们推测该基因在猪的肠道免疫中发挥着重要作用。

本研究克隆了猪的LTβR基因CDS,并进行了该基因在不同组织,不同肠段的表达谱研究。进一步,我们检测到该基因在第二个内含子中有一个A-G的突变,并检测了其在不同猪种中的基因型频率。为了检测LTβR在猪空肠上皮细胞系中的生物学功能,利用CRISPR/Cas9技术获得了LTβR敲除的IPEC-J2细胞系,并对野生型细胞系和敲除细胞系的增殖与凋亡进行了比较。本研究的主要发现和结论如下:1、分离了猪淋巴毒素β受体(LTβR)基因,其编码区序列长度为1515 bp(预测的分子量:45.58kDa;等电点:5.78),编码421个氨基酸。猪的LTβR编码序列与小鼠和人的同源性分别是81%和78%。2、利用RT-PCR及人淋巴毒素Β(LTB)ELISA KIT方法分析了LTβR基因的组织表达谱,确定其在不同组织中的表达水平。人淋巴毒素Β(LTB)ELISA KIT结果表明,猪LTβR基因在不同组织中表达量不同,在肝脏、肾脏、肺、脾及脂肪组织中表达量较高,肌肉组织如背肌、腿肌和心脏中几乎不表达该基因。在空肠中表达量高于十二指肠。3、用不同浓度的内毒素(LPS)和干扰素γ(IFNγ)处理IPEC-J2细胞14小时后,用QPCR及人淋巴毒素Β(LTB)ELISA KIT方法检测LTβR的表达水平,结果表明,用LPS和IFNγ处理,并不能激活和诱导LTβR的表达。

参考文献

[1]A Gene Regulatory Network Controls the Binary Fate Decision of Rod and Bipolar Cells in the Vertebrate Retina[J].Sui Wang;;Cem Sengel;;Mark M.Emerson;;Constance L.Cepko.Developmental Cell,2014

[2]Increase in the mediators of asthma in obesity and obesity with type 2 diabetes:Reduction with weight loss[J].Paresh Dandona;;Husam Ghanim;;Scott V.Monte;;Joseph A.Caruana;;Kelly Green;;Sanaa Abuaysheh;;Teekam Lohano;;Jerome Schentag;;Sandeep Dhindsa;;Ajay Chaudhuri.Obesity,2014(2)

[3]Higher-Order Assemblies in a New Paradigm of Signal Transduction[J].Hao Wu.Cell,2013

[4]Lymphotoxin-beta receptor activation on macrophages ameliorates acute DSS-induced intestinal inflammation in a TRIM30α-dependent manner[J]..Molecular Immunology,2012(2)

[5]Altawaty T.猪淋巴毒素β受体基因的克隆及其在IPEC-J2细胞中的功能研究[D].中国农业科学院,2018.