C-KIT抗体的应用

背景^[1-3]

C-KIT抗体也称为CD117抗体，是一个非偶联、分子量约110kDa的兔源、抗c-Kit多克隆抗体。这种抗体可用于人、小鼠、大鼠、猴子等多种背景下的WB、IHC-F、IHC-P、ICC/IF、ELISA等实验，并且不带标记。

C-KIT基因最初被鉴定为猫肉瘤病毒致癌基因v-kit的同系物，通常被称为原癌基因c-Kit。C-KIT抗体特异性地结合到这种糖基化跨膜蛋白上，该蛋白具有一个N端胞外区，该区具有五个免疫球蛋白样结构域、一个跨膜区和一个位于C端的胞内酪氨酸激酶结构域。当被其细胞因子配体、干细胞因子（SCF）激活后，该蛋白会磷酸化多种细胞内蛋白，这些蛋白在许多细胞类型的增殖、分化、迁移和凋亡中发挥作用。因此，C-KIT抗体在造血、干细胞维持、配子发生、黑色素生成以及肥大细胞的发育、迁移和功能等方面都有重要的应用价值。

C-KIT兔单克隆抗体则是通过用c-Kit蛋白对小鼠进行系统免疫，再取出脾脏细胞筛选出只分泌单一c-Kit蛋白抗体的B淋巴细胞，然后将此B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行杂交得到的。这种抗体广泛用于免疫组织化学，以帮助区分组织学组织切片中的特定类型的肿瘤。例如，C-KIT兔单克隆抗体可用于研究胃肠道间质瘤（GIST）中c-kit和PDGFRA基因突变的检测和临床诊断，为进一步的生物靶向治疗提供依据。

在制备和鉴定C-KIT抗体时，需要遵循一定的步骤和方法。首先，需要通过特定的方法制备出抗体，并进行效价的鉴定，包括试管凝集反应、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验等。然后，需要评估抗体的特异性，即与相应抗原或近似抗原物质的识别能力。此外，还需要测定抗体的亲和力，即抗体和抗原结合的牢固程度。

C-KIT抗体

C-KIT抗体的制备方法通常包括以下步骤：

1.免疫原的准备：首先需要准备C-KIT蛋白作为免疫原。这通常涉及到表达和纯化C-KIT蛋白。

2.动物免疫：将准备好的C-KIT蛋白注射到选定的动物（如小鼠、兔子等）体内，以刺激其免疫系统产生针对C-KIT的抗体。

3.血清采集：在动物产生免疫应答后，定期采集其血清，血清中含有针对C-KIT的特异性抗体。

4.抗体的纯化和筛选：通过一系列的技术手段（如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等）从血清中分离纯化出C-KIT抗体。同时，可以利用特定的筛选方法（如酶联免疫吸附试验、免疫印迹等）来检测抗体的特异性和亲和力。

5.抗体的鉴定和验证：对纯化后的抗体进行进一步的鉴定和验证，以确保其质量、特异性和活性。这包括测定抗体的效价、亲和力、交叉反应性等指标。

6.抗体的生产和储存：一旦获得满意的C-KIT抗体，就可以进行大规模的生产，并妥善储存以供后续使用。

需要注意的是，具体的制备方法可能因实验室条件、需求和目标而异。因此，在实际操作中，应根据具体情况进行调整和优化。

此外，还可以采用单克隆抗体技术来制备C-KIT抗体。这种方法涉及将已免疫动物的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。然后筛选出能够产生特异性C-KIT抗体的杂交瘤细胞株，并进行扩大培养和抗体生产。这种方法可以获得大量高度特异性的单克隆C-KIT抗体。

应用^[4][5]

C-KIT抗体可以用于c-kit+心脏祖细胞表达和分泌内皮细胞特征蛋白的研究

c-kit+心脏祖细胞(cardiac progenitor cells,CPCs)在缺血性心肌病的治疗中具有重要作用,但该细胞的属性仍未完全清楚。本实验将主要探究:1.从蛋白层面证明c-kit+CPCs可以表达和分泌内皮细胞特征相关的蛋白;2.c-kit+CPCs缺氧处理后,检测c-kit+CPCs表达和分泌细胞因子的变化。

研究方法:1.取成年雄性C57BL/6小鼠心脏切成约1mm3碎块,用II型胶原酶和胰蛋白酶消化成单个细胞培养扩增后,免疫磁珠标记进行c-kit+CPCs分选,免疫荧光、流式细胞术检测纯度。2.设置心肌细胞对照组(Car组)、c-kit+CPCs正常培养组(c-kit组),蛋白芯片检测内皮细胞特征蛋白及相关细胞因子的表达。3.检测缺氧处理对c-kit+CPCs分泌功能的影响:用缺氧小室对分选后的第三代c-kit+CPCs进行缺氧处理,缺氧处理组(c-kit hyp组)在37℃、5%二氧化碳、95%N2中培养,正常组(c-kit nor组)在37℃,5%二氧化碳和21%O2中培养。每组分别设置3、6、12小时。收集细胞培养上清液进行C-KIT抗体蛋白芯片检测,收集细胞裂解物进行蛋白印记(WB)检测。

C-KIT抗体研究结果:1.根据细胞表面标记c-kit进行阳性分选后获得高纯度c-kit+细胞,细胞呈现梭形、短棒状,形态较分选前明显统一,生长良好。2.分选后第三代细胞进行表面C-KIT抗体鉴定,几乎所有细胞呈现C-KIT抗体标记的红色荧光,流式细胞术鉴定发现分选前的混合细胞中c-kit+细胞比例约在1.34%,分选后细胞纯度约在95%,且在我们的培养体系下表面标志物可以稳定表达。3.c-kit组比Car组表达增加的因子有:内皮素-1(Endothelin-1)、半胱氨酸蛋白61(Cysteine-rich 61,Cyr61)、FGFbasic、胎盘生长因子2(Placenta Growth Factor-2,Pl GF-2)(P<0.05),这些因子具有内皮细胞分泌、在血管生成中起一定作用的特点。

4..C-KIT抗体hyp 3h组比c-kit nor 3h组表达增加的因子有:CXC趋化因子配体16(CXC chemokine ligand 16,CXCL16)、Angiopoietin-1、FGF basic、IL-1beta、人血小板衍生生长因子BB(Platelet derived growth factor,PDGF-BB)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、神经调节蛋白-1(Neuregulin-1,NRG-1)(P<0.05);c-kit hyp6h组和c-kit nor 6h组,蛋白芯片结果对比未发现有明显差异;c-kit hyp 12h组比c-kit nor 12h组表达增加的因子有:血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)(P<0.05)。

参考文献

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[2]Genome-edited adult stem cells:Next-generation advanced therapy medicinal products.[J].Benabdellah Karim;;Sánchez-Hernández Sabina;;Aguilar-González Araceli;;Maldonado-Pérez Noelia;;Gutierrez-Guerrero Alejandra;;Cortijo-Gutierrez Marina;;Ramos-Hernández Iris;;Tristán-Manzano María;;Galindo-Moreno Pablo;;Herrera Concha;;Martin Francisco.Stem cells translational medicine,2020

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