重组胰蛋白酶残留ELISA分析法的特点

概述^[1]

重组胰蛋白酶是采用基因工程技术生产，经过分离纯化获得的高纯度、高活性重组胰蛋白酶。

用途^[1]

1、哺乳动物细胞感染病毒疫苗的生产；2、治疗性及原代细胞的培养；3、干细胞培养；4、重组蛋白的生产。重组胰蛋白酶残留ELISA分析法是一种双抗体夹心法建立的制品中残留的胰蛋白酶ELISA分析法。

特点^[1]

1、操作方便简单，已经配备了全部分析用溶液，可直接用于样品分析；2、重现性好，稳定性高；3、产品分析线形范围为1~500ng/ml。ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体—聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

实验材料和器材^[1]

1、试剂

(1)包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):NaCO₃ ：1.59克、NaHCO₃：2.93克，加蒸馏水至1000ml

(2)洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M　KH₂PO₄ 0.2克　Na₂HPO₄·12H₂O　2.9克　NaCl  8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸馏水至1000ml

(3)稀释液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1克　加洗涤缓冲液至100ml　或以羊血清、兔血清等 血清与洗涤液配成5～10%使用。

(4)终止液(2M H₂SO₄）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98%)21.7ml。

(5)底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸)：0.2M Na₂HPO₄(28.4克/L) 25.7ml　0.1M 柠檬酸(19.2克/L) 24.3ml　加蒸馏水50ml。

(6)TMB(四甲基联苯胺)使用液：TMB(10mg/5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml 0.75% H₂O₂32μl。

(7)ABTS使用液：ABTS　0.5mg　底物缓冲液(PH5.5) 1ml3% H₂O₂2μl。

(8)抗原、抗体和酶标记抗体。

(9)正常人血清和阳性对照血清。

2.　器材:

(1)　聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。

(2)　小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。

(3)　4℃冰箱，37℃孵育箱。

主要参考资料

[1] ELISA的实验原理和操作步骤