HuH7（人肝癌细胞）的应用

背景^[1-3]

HuH7（人肝癌细胞）细胞是一种高分化肝癌细胞系，最初是从一名57岁的日本男性肝癌患者的肝脏肿瘤组织中建立的。这种细胞系已被广泛用于生物医学研究，特别是在丙型肝炎病毒（HCV）和乙型肝炎病毒（HBV）感染、肝癌发生机制、药物筛选和基因治疗等方面的研究。

HuH7（人肝癌细胞）细胞具有多种生物学特性，如上皮样形态、贴壁生长、AFP阳性等。这些细胞对HCV具有高度敏感性，因此被广泛用于HCV感染的体外研究。此外，HuH7（人肝癌细胞）细胞还可以支持HBV的复制和生命周期，为HBV感染的研究提供了有力的工具。

在细胞培养方面，HuH7（人肝癌细胞）细胞需要特定的培养基和条件来维持其生长和活性。一般来说，这些细胞可以在含有DMEM培养基、胎牛血清（FBS）和抗生素的培养基中生长。此外，细胞的传代和冻存也需要遵循一定的操作规程，以确保细胞的稳定性和可靠性。

除了用于病毒学研究外，HuH7（人肝癌细胞）细胞还可以用于研究肝癌的发病机制、药物筛选和基因治疗等方面。例如，科学家们可以利用这些细胞研究肝癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等过程，以及评估不同药物对肝癌细胞的疗效。此外，HuH7细胞还可以作为基因治疗的靶细胞，用于研究肝癌的基因治疗和免疫治疗等。

HuH7（人肝癌细胞）

HuH7（人肝癌细胞）培养操作

1)复苏HuH7（人肝癌细胞）：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)HuH7（人肝癌细胞）传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)HuH7（人肝癌细胞）冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

HuH7（人肝癌细胞）可以用于CD36在肝癌索拉菲尼耐药中的作用与机制研究

建立索拉菲尼诱导的肝癌耐药细胞株。选取HuH7（人肝癌细胞）,用索拉菲尼间歇诱导方法建立Huh7索拉菲尼耐药细胞系(Huh7/SR)。通过CCK8,结晶紫染色和流式细胞术等实验检测Huh7/SR的耐药性,并用显微镜观察HuH7（人肝癌细胞）/SR在形态学上的改变。对Huh7/WT和Huh7/SR中的脂滴进行BODIPY(493/503)染色。

采用荧光定量PCR和WB方法检测CD36在HuH7（人肝癌细胞）/WT和HuH7（人肝癌细胞）/SR中的表达差异。同时用流式细胞术检测Huh7/WT与Huh7/SR中CD36的表达差异。构建高表达CD36的肝癌细胞系(Huh7/Hep G2 CD36 OE)。通过CCK8,结晶紫染色和流式细胞术等实验检测Huh7/Hep G2 NC和Huh7/Hep G2 CD36 OE在增殖和凋亡方面的差异。构建CD36干扰的肝癌索拉菲尼耐药细胞模型,用WB鉴定CD36的干扰效果。通过CCK8,结晶紫染色和流式细胞术实验及数据检测分析CD36干扰对耐药细胞增殖和凋亡方面的作用。

判断ERK磷酸化水平与肝癌索拉菲尼耐药是否相关。先用WB检测HuH7（人肝癌细胞）/WT和HuH7（人肝癌细胞）/SR的ERK磷酸化水平的差异。然后用丝裂原活化蛋白激酶抑制剂(U0126)处理Huh7/SR,通过WB检测U0126对Huh7/SR中ERK和p-ERK蛋白表达的影响。最后通过CCK8,细胞集落形成以及流式细胞术等实验检测U0126对Huh7/SR在增殖和凋亡方面的影响。接着检测CD36是否通过调节ERK影响肝癌细胞对索拉菲尼的敏感性。

先将实验对象分为4组:HuH7（人肝癌细胞）NC、Huh7NC+sorafenib、Huh7 CD36 OE、Huh7 CD36 OE+sorafenib,利用WB实验检测在索拉菲尼的作用下,CD36对ERK磷酸化的影响。同时干扰耐药细胞中的CD36,用WB检测HuH7（人肝癌细胞）/SR NC和HuH7（人肝癌细胞）/SR si CD36中ERK磷酸化水平的差异。接下来在si CD36的耐药细胞上进行回复实验。实验对象分为3组:Huh7/SR NC、Huh7/SR si CD36、Huh7/SR si CD36+SEI,先使用ERK激动剂洋川芎内酯Ⅰ(SEI)处理细胞8小时,然后加入5umol/L的索拉菲尼处理12h,通过CCK8和流式细胞术实验检测这三组细胞在增殖和凋亡方面的差异。

结果:CCK8实验显示,在索拉菲尼的处理下,HuH7（人肝癌细胞）/SR的增殖能力明显高于Huh7/WT。结晶紫染色实验证实,HuH7（人肝癌细胞）/SR较Huh7/WT细胞死亡减少,活性细胞数上升(P<0.01)。HuH7（人肝癌细胞）/WT原本是巨团样,经过索拉菲尼药物的长期处理后,细胞在形态上发生了改变,耐药细胞主要变成了长梭形。细胞凋亡实验发现,在索拉菲尼的处理下,Huh7/SR细胞较Huh7/WT细胞凋亡减少(P<0.05)。

参考文献

[1]ERK:A Double-Edged Sword in Cancer.ERK-Dependent Apoptosis as a Potential Therapeutic Strategy for Cancer[J].Sugiura Reiko;Satoh Ryosuke;Takasaki Teruaki.Cells,2021

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[4]Effect of the Hypoxia Inducible Factor on Sorafenib Resistance of Hepatocellular Carcinoma[J].Zeng Zhi;Lu Qiliang;Liu Yang;Zhao Junjun;Zhang Qian;Hu Linjun;Shi Zhan;Tu Yifeng;Xiao Zunqiang;Xu Qiuran;Huang Dongsheng.Frontiers in Oncology,2021

[5]陈琳.CD36在肝癌索拉菲尼耐药中的作用与机制研究[D].重庆医科大学,2023.