大鼠气管平滑肌细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠气管平滑肌细胞，是一种在生物医学研究中常用的细胞类型。这些细胞来自于大鼠的气管，具有平滑肌细胞的特性，可以收缩和舒张。

在研究中，大鼠气管平滑肌细胞常被用于模拟人体内的平滑肌细胞行为，以研究平滑肌细胞的功能、生理和病理过程。此外，这些细胞也被用于药物筛选、细胞治疗、基因编辑等研究中，以评估新药物或治疗方法对平滑肌细胞的影响，以及探索平滑肌相关疾病的治疗方法。

然而，由于大鼠气管平滑肌细胞来自于动物，因此在实验过程中需要考虑到物种差异和伦理问题。同时，为了确保实验结果的准确性和可靠性，研究人员需要严格遵守细胞培养和实验操作的规范，确保细胞的纯度和活性。

大鼠气管平滑肌细胞）

大鼠气管平滑肌细胞培养操作

1)复苏大鼠气管平滑肌细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)大鼠气管平滑肌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)大鼠气管平滑肌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

大鼠气管平滑肌细胞可以用于黄芩苷对大鼠气管平滑肌细胞内钙离子浓度的影响

通过探讨黄芩苷对Rat Tracheal Smooth Muscle Cells大鼠气管平滑肌细胞内钙离子浓度的影响及相关机制,对黄芩苷的药理作用机制作进一步补充,为其临床应用提供相应的实验依据。

方法：大鼠气管平滑肌细胞的原代培养,随机分为对照组、黄芩苷组、亚甲基兰(MB)+黄芩苷组、左旋氮氨酸精氨酸甲酯(L-NAME)+黄芩苷组以及细胞外液无钙组(对照组与黄芩苷组),采用钙离子荧光探针Fluo-3/AM标记培养的Rat Tracheal Smooth Muscle Cells平滑肌细胞内钙离子,在激光共聚焦显微镜下连续扫描；健康的成年SD大鼠20只,(雌雄不拘)随机分为对照组、黄芩苷组。颈椎脱臼法处死后迅速分离气管,黄芩苷组用终浓度8×104M黄芩苷的Krebs液37℃液孵育40mmin,对照组加等同黄芩苷量的PBS液孵育。采用免疫组化法测定诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达,按照一氧化氮合酶检测试剂盒的方法测NOS的活性。所有数据用SPSS17.0统计软件进行分析。

结果1.黄芩苷组细胞内Ca2+荧光强度值在5min和10mmin后分别是2492.791±5.730和1689.097±=5.202(n=10)与对照组细胞内Ca2+荧光强度值5min和l0min后3839.368±6.035和3860.163±7.607(n=10)相比明显降低(P<0.01),说明黄芩苷明显的降低了细胞内Ca2+浓度；MB+黄芩苷组细胞内Ca2+荧光强度值在5min和10min后分别是3009.596±5.296和3032.298±5.192(n=10)与黄芩苷组相比大鼠气管平滑肌细胞细胞内Ca2+浓度升高说明MB阻断了黄芩苷促进乌苷酸环化酶(GC)减少细胞内Ca2+的作用(P<0.01);L-NAME+黄芩苷组细胞内Ca2+荧光强度值在5min和10min后分别是3113.462±6.028和3130.269±6.114(n=10)与黄芩苷组相比细胞内Ca2+浓度升高,说明L-NAME抑制了黄芩苷促进NO合成减少细胞内Ca2+的作用(P<0.01)。

2. 大鼠气管平滑肌细胞细胞外液无钙时,对数据进行统计学分析,黄芩苷组与对照组相比P>0.05,无统计学意义。表明黄芩苷是通过抑制细胞外的钙离子进入细胞内。

3. 大鼠气管平滑肌细胞）对照组和黄芩苷组iNOS阳性区平均灰度值分别是114.883±6.568和155.614±5.012(n=15),有显著差异(P<0.01)。

4. 黄芩苷组NOS的活性为对照组的1.55±0.02倍,有显著差异(P<0.01)。

结论黄芩苷明显降低大鼠气管平滑肌细胞内钙离子浓度,可能与其增强大鼠气管一氧化氮合酶的表达及活性有关。

参考文献

[1]Aldosterone Inactivates the Endothelin-B Receptor via a Cysteinyl Thiol Redox Switch to Decrease Pulmonary Endothelial Nitric Oxide Levels and Modulate Pulmonary Arterial Hypertension[J].Bradley A.Maron;;Ying-Yi Zhang;;Kevin White;;Stephen Y.Chan;;Diane E.Handy;;Christopher E.Mahoney;;Joseph Loscalzo;;Jane A.Leopold.Circulation,2012(8)

[2]Nitroglycerin Fails to Lower Blood Pressure in Redox-Dead Cys42Ser PKG1αKnock-In Mouse[J].Olena Rudyk;;Oleksandra Prysyazhna;;Joseph R.Burgoyne;;Philip Eaton.Circulation,2012(3)

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[4]Genetic Variation in Glutathione S-Transferase Genes and Risk of Nonfatal Cerebral Stroke in Patients Suffering from Essential Hypertension[J].Alexey Polonikov;Ekaterina Vialykh;Oksana Vasil’eva;Irina Bulgakova;Olga Bushueva;Thomas Illig;Maria Solodilova.Journal of Molecular Neuroscience,2012(3)

[5]朱慧英.黄芩苷对大鼠气管平滑肌细胞内钙离子浓度的影响[D].郑州大学,2015.