生物缓冲剂的应用

背景及概述^[1]

生物缓冲剂(HEPES)项目目前国内开发生产处于起步阶段，该技术采用国际先进的技术进行生产加工，生产过程中无污染，无废弃物，可以实现清洁生产，具有良好的科技示范作用。生物缓冲剂(HEPES)产品化学名称为：N-羟乙基哌嗪-1-乙磺酸，产品为白色结晶粉末。生物缓冲剂(HEPES)是以价格低廉的化工产品为原料，在高温、一定的压力以及催化剂的作用下，经多步化工单元操作精制而得，是生物学研究中高品质、高技术含量的生化产品，广泛应用于临床检验诊断试剂、生命科学研究、制药和生物技术等诸多领域。

制备^[1]

生物缓冲剂(HEPES)以低廉的化工产品为原料，在高温、一定压力和催化剂的作用下，经萃取、结晶、耦合分离等经多步化工单元操作精制而得的。

生产制取生物缓冲剂技术的关键在于HEPES在反应中的相态变化对其成本和质量的影响。国内研发生产技术采用有机溶剂(由固态变为液相-湿法)进行试制。湿法工艺溶剂用量大，蒸发消耗大量能源，并且溶剂在最终产品上有残留，色度和含量均在国际标准的下限范围之外，产品比国际市场上的产品质量差，消耗高。所生产出的生物缓冲剂成本高，在市场上没有竞争力。因此，国内生产技术一直没有突破性进展。可见，如何解决HEPES产品的相态变化对最终产品的影响，就成为降低加工成本、改善产品质量的关键技术问题。国外采用催化反向结晶法，关键点是催化剂的加入时间和加入速度，否则产生包裹现象，严重影响产品质量。

应用^[2-6]

生物缓冲剂HEPES溶液是一种弱酸，是一种有机化工中的两性离子缓冲剂。该物质的分解能力可随温度的升高而增强，随温度的降低而减弱，但与其他缓冲剂相比，它的分解常数随温度变化不大，这使HEPES缓冲液成为在低温时可较好地保持酶的结构和功能的缓冲剂。该缓冲剂能较长时间控制恒定的pH范围，对细胞无毒性作用，常用于细胞培养。其应用举例如下：

1）生物缓冲剂 HEPES 对促进口蹄疫抗原稳定性的研究。

口蹄疫抗原在储存和疫苗制备过程中容易降解，影响疫苗效果。口蹄疫抗原的降解速度与维持液的pH值的稳定性有关，制备出pH稳定性强的维持液可提高口蹄疫疫苗质量。对生物缓冲剂HEPES进行研究，分别用含有和不含有HEPES的MEM维持液在BHK细胞上培养病毒，将病毒放在37℃温箱内，分别在0、24、48、72h取样，通过微量细胞中和试验检测病毒效价，并进行比较。结果表明，在37℃条件下，不含生物缓冲剂的病毒液TCID50下降幅度比含生物缓冲剂的病毒液大，72h时，前者毒价为零，后者TCID50为10-2.5。由此可知，HEPES可以有效地改善病毒培养液缓冲能力，促进病毒颗粒的稳定性。

2）制备一种含生物缓冲剂的护肤品，包含微生物发酵产物提取物，其特征在于：还包含质量百分比为0.1%-3.0%的生物缓冲剂。本发明具有如下优点：产品pH值漂移幅度小，在护肤品制备后的三年内，其pH值能稳定在6.0-8.0，对添加其中的的微生物发酵产物提取物有很好的保护，微生物发酵产物提取物不容易被水解，产品抗衰老功效持续时间长。

3）制备一种检测25-羟基维生素D3含量的试剂盒。

所述试剂盒由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；其中，试剂Ⅰ的组分包括：25-羟基维生素D3-BSA偶联物、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、促凝剂、防腐剂、稳定剂和水；试剂Ⅱ的组分包括：包被25-羟基维生素D3抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、助悬剂、防腐剂、封闭剂、稳定剂和水。本发明试剂盒检测灵敏度高，特异性强，定量准确，线性范围宽，尤其适用于25-羟基维生素D3含量极低样品的检测。此外，本发明试剂盒在检测过程中不需对样本进行预稀释，方便临床使用，操作简单、检测成本低，适用于各种全自动生化分析仪。

4）制备乳酸脱氢酶检测试剂盒。

本发明试剂盒由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；其中，试剂Ⅰ的组分包括：生物缓冲剂，金属离子络合物，乳酸脱氢酶的反应底物，表面活性剂，乳酸脱氢酶酶活激活剂，防腐剂和水；试剂Ⅱ的组分包括：生物缓冲剂，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态，表面活性剂，防腐剂和水。本发明检测试剂盒采用双试剂模式有效避免了非特异性反应的干扰，同时可限度减少来自样本本身浊度的干扰，保证了测定结果的稳定可靠，具有稳定性好，精确度高，线性测试范围宽，重复性好，抗干扰性强等优点。此外，本发明检测试剂盒在检测过程中不需对样本进行预稀释，方便临床使用，操作简单、快速，适用于全自动生化分析仪。

5）制备一种神经元特异性烯醇化酶含量检测试剂盒，属于人体神经元特异性烯醇化酶含量检测领域。

所述检测试剂盒由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成，其中，试剂Ⅰ的组分包括：生物缓冲剂、防腐剂、促凝剂、无机盐和水；试剂Ⅱ的组分包括：包被神经元特异性烯醇化酶抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、防腐剂、助悬剂和水。本发明用神经元特异性烯醇化酶单克隆体和多克隆抗体复合包被粒径为80-240nm的胶乳颗粒，保证检测试剂盒具有高灵敏度及较宽的检测线性范围，具有操作简便、快速、特异性强、稳定性好，灵敏度高等优点。

主要参考资料

[1]缓冲剂(HEPES)生产技术

[2] 生物缓冲剂HEPES对促进口蹄疫抗原稳定性的研究

[3] CN201210302620.1一种含生物缓冲剂的护肤品

[4] CN201210351495.325-羟基维生素D3检测试剂盒及其制备方法和应用

[5] CN201210270384.X乳酸脱氢酶检测试剂盒及其制备方法

[6] CN201310055143.8神经元特异性烯醇化酶含量检测试剂盒及其制备方法