葫芦素B的作用

背景及概述^[1-2]

葫芦素B ( cucurbitacin B ) 是从葫芦科等植物中分离得到的一类四环三萜类化合物，是葫芦素家族中含量最丰富的成员，具有广泛的药理活性。现代研究表明，葫芦素B 具有保护肝、消炎和抗肿瘤等多种生物学活性。20 世纪70 ～ 80年代，国内已研发出葫芦素片( 含葫芦素B 和葫芦素E)用于肝炎和原发性肝癌的辅助治疗。

近年来，国内外学者对葫芦素B 的抗肿瘤作用进行了较为系统的研究，发现葫芦素B 具有较强的抑制STAT3 转录因子活化的作用，并认为其抗肿瘤活性与抑制STAT3 转录因子的活化有关。然而，也有不少研究报道，葫芦素B 的药理活性与抑制STAT3转录因子的活化无关。目前较多研究表明，葫芦素B可导致肌动蛋白细胞骨架的快速破坏，这种作用与其抗肿瘤作用密切相关。由此可见，葫芦素B 抗肿瘤作用机制还存在争议，待深入研究。

结构

作用机制^[1]

葫芦素B 有广泛抗肿瘤活性，其抗肿瘤机制可能包括以下几方面。

1）葫芦素B 诱导细胞凋亡

细胞凋亡和细胞增殖都是生命的基本现象，是维持体内细胞数量动态平衡的基本措施，而肿瘤细胞过度增殖和凋亡抑制，造成其无限制增殖。因此利用各种治疗手段促进肿瘤细胞凋亡是抗肿瘤治疗的重要策略之一。葫芦素B主要通过抑制Bcl-2、激活Caspase 瀑布、降解PAＲP 从而诱导内源性细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。

2）葫芦素B 诱导细胞周期阻滞

高等真核细胞细胞周期的调节依赖于细胞周期蛋白( cyclin) 和细胞周期蛋白依赖性激酶( cyclin-dependent kinases，CDKs) 。多项研究均显示葫芦素B 通过降低CyclinB1、CDC2 和cdc25C 的表达，增加P21 和P53 的表达使多种肿瘤细胞阻滞于G2 /M 期。

3）葫芦素B 可破坏细胞骨架

实验研究表明葫芦素B 可快速改变乳腺癌MCF-7细胞形态，使F-actin 和微管聚集，以致细胞骨架结构破坏。葫芦素B 被认为是第三种以微管为靶点的药物(紫杉类、长春碱类、现在的葫芦素B) 。葫芦素B 还能使恶性胶质瘤细胞的细胞骨架破坏从而影响细胞的迁移。

4）葫芦素B 阻断细胞信号传导途径

肿瘤的发生发展总与细胞信号传导通路的异常有关，而葫芦素B 可影响多条信号传导通路。近期多项研究发现葫芦素B 可抑制STAT3 的磷酸化，从而抑制细胞增殖、促进细胞凋亡等。STAT3 已被认为是一种癌基因。葫芦素B 可通过反式激活ＲelA/p65 抑制NF－ kappaB 信号通路。

应用^[1]

围绕葫芦素B 的抗肿瘤作用，人们开展了多项研究，结果表明葫芦素B 对某些肿瘤细胞系和动物模型有明显的抗肿瘤作用。

1. 肝癌

研究指出葫芦素B 抑制肝细胞癌HepG2 细胞的生长增殖，主要通过抑制STAT3 磷酸化，降低Bcl- 2 表达，诱导肿瘤细胞凋亡。葫芦素B 对另一肝细胞癌BEL- 7402 细胞有抑制作用，并在体内实验中以1 mg /kg 的剂量口服能显著抑制移植瘤生长。

2. 乳腺癌

葫芦素B 通过破坏细胞骨架，抑制乳腺癌细胞生长增殖，并认为葫芦素B 也许是第三种以微管为靶点的药物( 紫杉类、长春碱类、现在的葫芦素B) 。进一步探索发现葫芦素B 对三阴性乳腺癌细胞SKBＲ- 3的抑制作用更为明显，其也许通过下调hTEＲT 和c- myc、抑制端粒酶，发挥抗肿瘤作用。近期研究发现葫芦素B诱导乳腺癌细胞凋亡和生长抑制的部分原因也许是wnt 信号传导通路的抑制。

3. 喉癌

研究发现葫芦素B 通过抑制STAT3 信号通路发挥对喉癌细胞Hep- 2 的抗肿瘤作用，并且在动物模型中其也能抑制移植瘤生长。进一步探索，在体外和体内实验中证明葫芦素B 联合多西他塞或顺铂均可协同抑制喉癌生长。

4.胰腺癌

葫芦素B 可显著抑制多种胰腺癌细胞( MiaPaCa- 2、PL45、Panc- 1 和AsPc- 1) 生长，其抑制作用与JAK2、STAT3、和STAT5 抑制而引起的G2 /M期阻滞和细胞凋亡有关。而且还发现葫芦素B 和吉西他滨对胰腺癌细胞具有协同抑制作用。

5. 其他肿瘤

葫芦素B 对其他恶性肿瘤细胞系也表现出显著抗肿瘤作用。葫芦素B 可通过增加活性氧(ＲOS) 和一种抗氧化剂来抑制结肠癌细胞SW480。研究发现葫芦素B 通过ＲOS依赖的G- actin 池降解使actin 聚集从而抑制黑色素瘤B16F10 细胞的生长和侵袭，而且还发现丙戊酸(VPA) ，一种组蛋白脱乙酰基酶可增强B16F10 对葫芦素B 处理的敏感性。还有研究表明葫芦素B 可显著抑制皮肤鳞状细胞癌的增殖。

6. 葫芦素B 与其他化疗药物的协同作用

在临床上，很多药物联合应用，不仅增强疗效而且避免耐药细胞产生和降低药物毒性。有一些研究显示葫芦素B联合化疗药物对肿瘤细胞有协同作用，如现在胰腺癌动物模型中，葫芦素B 联合吉西他滨具有协同作用，且不增加毒性研究显示葫芦素B 和顺铂的协同作用。葫芦素B 联合其他化疗药物值得进一步研究。

7. 葫芦素B 引起细胞自噬

研究发现葫芦素B 可以增加黑色素瘤B16F10 细胞中eIFα 磷酸化水平和自噬相关蛋白LC- 3Ⅱ表达。但是葫芦素B 能否像其他作用于细胞骨架的药物一样，引起内质网应激( EＲ stress) 和自噬，并且引起的自噬是否影响细胞增殖生长还有待进一步研究。

制备 ^[3-4]

方法1：一种葫芦素B的提取分离方法，包括如下步骤：

1)将原料甜瓜蒂粉碎，用乙醇渗漉乙醇回流提取，提取液浓缩以后，用乙酸乙酯萃取三次以上，回收乙酸乙酯，即得总葫芦素提取物；

2)取总葫芦素提取物溶于体积分数25～45％的乙醇水溶液中，在醋酸存在下进行水解反应，充分反应后调节pH值至中性，浓缩至干；所述醋酸的浓度为0.1～0.3mol/L；

3)步骤2)所得浓缩物经纯化处理得到葫芦素B含量在60％以上的葫芦素B产品。

方法2：一种从甜瓜蒂中制备高纯度葫芦素B的方法。首先采用微波逆流提取葫芦素，提高了产品的得率。通过大孔树脂对其进行纯化，大孔树脂再生方便，适合大生产，容易操作。大孔树脂和硅胶柱层析结合，分离和纯化效果好，最后采用重结晶，使产品纯度进一步提高，最终得到含量90％以上的葫芦素B终产品。它包括以下步骤：

(1)微波逆流提取：将甜瓜蒂粉碎，过筛60-80目，加入60-80％甲醇溶液，在400-600W，时间60- 120min，8-12倍料液比条件下微波逆流提取，正向进料，反向进水，物料与水的流动为逆向连续动态流动，得到含有葫芦素的提取液；

(2)活性炭脱色：将提取液减压浓缩至无醇，加入0.25-0.40倍量的活性炭，室温条件下，机械搅拌脱色0.5h，过滤除去活性炭；

(3)树脂纯化：将溶液采用大孔吸附树脂进行吸附，吸附完毕用水以4-6BV/h流速洗去水溶性杂质，洗脱体积为5-7BV，然后用60％-90％的乙醇溶液以1-3BV/h流速洗脱，洗脱体积为4- 6BV，得葫芦素B洗脱液，将洗脱液浓缩至浸膏，真空冷冻干燥，得葫芦素B粗粉；

(4)硅胶柱层析：将所得葫芦素B粗粉溶于乙酸乙酯加适量硅胶搅拌，烘干过60-80目筛，干法上样，上硅胶柱层析，以氯仿-甲醇溶液进行洗脱，薄层色谱法跟踪检测，收集葫芦素B各阶段洗脱液；

(5)重结晶：将所收集的葫芦素B洗脱液浓缩，冷冻干燥得粉末。用乙酸乙酯水溶液溶解，过滤，回收乙醇，浓缩，放置析出晶体，再反复重结晶两次，得到高纯度葫芦素B。

主要参考资料

[1] 葫芦素B 抗肿瘤作用的研究进展

[2] 葫芦素B 抗肿瘤作用及其机制研究进展

[3] CN200910154837.0 一种葫芦素B的提取分离方法

[4] CN201610922396.4 一种从甜瓜蒂中提取葫芦素B的方法