基因沉默的发现和应用

背景及概述^[1-2]

基因沉默是指生物体内基因表达调控的重要手段，主要表现为特定基因的表达量下调或表达受到抑制。基因沉默主要有两种，转录水平上的基因沉默和转录后基因沉默。前者主要包括基因甲基化、位置效应、同源基因的反式失活、后成修饰作用以及重复序列引起的基因沉默；后者主要包括共抑制和RNA干扰引起的基因沉默。基因沉默广泛存在于植物体中，是一种基因表达调控和抵御病毒侵害的重要机制。基因（Gene）是个体表型的决定因素，在疾病的发生中起重要作用。通过基因沉默技术抑制与疾病相关基因的表达从而实现疾病防治已成为当

代研究的热点．20世纪90年代，在转基因植物中首先发现基因沉默现象，接着在线虫、真菌、水螅、果蝇以及哺乳动物中也陆续发现，到目前为止已有核酶技术、反义寡核酸技术等多种基因沉默技术相继应用于基因沉默研究中，近年新兴的基因敲除技术与RNA干扰技术为研究与开发新型抗肿瘤药物提供了新的思路。基因沉默技术具有特异性、高效性、靶点的多样性与选择性、效应的可遗传性、放大效应等特点，因而在临床中有广阔的应用空间，有望给肿瘤的治疗带来革命性的进展。

发现^[1]

1995年，美国康奈尔大学利用RNA反义技术研究秀丽线虫的par-1基因功能时发现，将与目的基因mRNA互补的反义RNA导入线虫细胞，引起目的基因沉默。后将与mRNA序列相同的正义RNA导入细胞，出现相同的结果。1998年线虫基因组计划完成之后，马萨诸塞大学医学院和卡耐基研究院发现遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，是由于体外转录得到的RNA中污染了微量的dsDNA造成的，首次在秀丽线虫中证明上述现象属于转录后水平的基因沉默。他们首先将体外转录得到的单链RNA（ssRNA）纯化，然后注射到线虫体内，发现基因抑制效应变的微弱。与之相反的是，经过纯化的dsRNA能够高效特异性阻断相应基因的表达，且抑制基因表达的效率较纯化前的反义RNA至少提高了2个数量级。该小组将这一现象称为RNA干涉，从此诞生了新的基因功能研究领域。

基因沉默机制^[1]

RNAi引起的转录后基因沉默分为起始阶段和效应阶段：起始阶段是长链dsRNA被切割为21～23bp长的小分子干扰RNA片段（sRNA）的过程；效应阶段是与siRNA互补的mRNA降解的过程。

1)起始阶段　

由外源导入或者由转基因、病毒转染等途径引入的双链RNA，被Dicer酶（RNAseIII家族的成员，广泛存在于各种生物体内。）降解为21～23bp的双链sRNA，这些sRNA具有3羟基末端、5磷酸及有2bp的3突出端，与所作用的靶mRNA序列具有同源性，从而在RNAi调控途径中起着关键的作用。

2)效应阶段　

在解旋酶的作用下，siRNA可解链成为正义链和反义链，其中的反义链可指导形成一种核蛋白体复合物，称之为RNA诱导的沉默复合体（RISC）。RISC是一种核糖蛋白，包含有蛋白成分和RNA，其中的RNA即是siRNA。核酸内切酶、外切酶、解旋酶及同源RNA链等组成其蛋白成分。在线虫体内，仅少量的dsRNA分子就可以引起大量mRNA的降解，并能向邻近的区域进行扩展，这表明某个信号扩散传递的现象可能存在于该过程，这种现象被称为传递RNAi。但传递RNAi现象的机制人们一直在研究。可能传递RNAi现象RNA是利用原来的siRNA作为引物重新合成dsRNA，此过程需要一个RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）作用，然后再通过DiCeR作用成为次级siRNA，形成新的siRNA又进入上述的循环，进一步作用于靶向mRNA，这一过程也被称为随机降解性聚合酶链反应。

应用^[1，3]

1. 基因沉默干扰在各种肿瘤中的应用

1)基因沉默干扰在鼻咽癌治疗中的应用　

有研究显示以腺病毒相关病毒为载体，包装合成表达针对LMP-1的siRNA，并对EBV阳性的人类鼻咽癌C666-1细胞系感染，感染前后观察细胞存活率和跨膜侵袭能力，结果发现细胞存活率及跨膜侵袭能力在感染后明显下降。在体内实验中，癌细胞转移少，肿瘤转移率降低，但肿瘤大小差异无统计学意义，不能表明抑制LMP-1后肿瘤生长受影响。RNAi可以抑制病毒癌基因的表达，能够抑制鼻咽癌癌细胞的生长，甚至使鼻咽癌癌细胞凋亡，从而降低鼻咽癌的侵袭能力，降低鼻咽癌转移的发生率。

2) 基因沉默在肺癌治疗中的应用　

研究肺癌的基因治疗是医学界的热点问题。Ras蛋白是一种由Ras基因编码的GTP结合蛋白，该蛋白具有GTP酶活性，是种重要的信号转导分子。人类肺癌的发生与KRa　V12突变基因的表达密切相关。有研究人员用针对K-Ras　V12表达的siRNA对肺癌细胞系H441进行感染，结果降低了K-Ras的mRNA表达量，Ras蛋白表达水平也降低，转染后的细胞较对照组的细胞增殖速度降低，细胞凋亡的数目增高。在体内实验中，裸鼠肿瘤的生长也可受到siRNA的影响而被抑制。

3) 基因沉默在卵巢癌治疗研究中的应用　

利用基因重组技术，将PPO基因的CDNA装入PCDNA／His载体，然后对ＮIH／3T3细胞株进行转染，筛选出具有增殖活性并能稳定表达的单克隆细胞株，然后用PPO的RNA干扰此细胞株，结果发现PCＮA的表达降低，P-MEK表达量减少。对卵巢癌细胞株OVK18和OVCAR-3进行RNAi后，注入裸鼠体内进行体内实验结果证实，实验组和对组肿瘤的大小差异有统计学意义，表明卵巢癌细胞在活体上的生长受到抑制。

4) 基因沉默在喉癌治疗中的应用　

有研究利用基因重组技术，构建蛋白激酶CKZα靶向siRNA表达质粒PsiRNA-HHLnEO-CKZ的脂质体，转染法转染HEP-2细胞，观察其对人喉癌细胞系HEP-2的侵袭是否有抑制作用，结果显示HEP-2细胞蛋白激酶CKZα的表达能被蛋白激酶CKZα靶向siRNA表达载体抑制，HEP-2细胞侵袭力降低。

5) 基因沉默在乳腺癌治疗中的应用　

完成针对人VEGF-C基因的siRNA表达载体的构建后，转染乳腺MDA-MB-43细胞，利用RNAi技术沉默VEGF-C基因。结果表明转染后VEGF-C基因及蛋白水平表达量明显减少，COX-2和BCL-2的表达水平降低，细胞体外生长状态不佳，细胞凋亡明显增多，转染72H后凋亡率达到60％，乳腺癌MDA-MB-43细胞的凋亡率显著高于对照组。

2. 基因沉默技术在抗真菌病害中的应用

真菌病害严重威胁作物的产量和品质，给国家和人民造成巨大的经济损失。尤其是引起维管束病害的土传真菌，化学农药的作用效果很不理想。利用抗性基因进行遗传育种是目前生物防治的重要手段之一，但对于缺乏抗性资源的物种，面对强大的土壤真菌病害，研究者也时常束手无策。近年来，利用RNA干扰技术发展而来的宿主诱导的基因沉默(HIGS)策略，在抗病虫害领域逐渐崭露头角，但由于真菌侵染的复杂多样性及土壤传播的特性，HIGS在土壤真菌病害中的应用充满神秘和挑战。有研究近期揭示了棉花黄萎病(一种严重的土壤真菌病害)的"罪魁祸首"——大丽轮枝菌的侵染结构和侵染过程；并首次证明了宿主植物内源小RNA能够跨界进入病原菌细胞中降解致病基因表达的抗病作用；在此基础上，利用HIGS在棉花上获得了对黄萎病抗性较高的品系，成功地开辟了抗土壤黄萎真菌病害的新天地，研究结果显示出基因沉默技术在这一领域强大的应用潜力和前景。

主要参考资料

[1] 基因沉默治疗恶性肿瘤的研究进展

[2] 基因沉默技术及其在棉花中的应用

[3] 基因沉默技术在抗真菌病害中的应用和展望