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DNA pulldown试剂盒

发布日期:2020/1/21 13:54:16

背景[1-7]

DNA pulldown试剂盒利用预先使用BSA、寡核苷酸随机引物封闭磁珠,降低了磁珠与蛋白、基因组DNA的非特异性结合。DNA pulldown技术是一种用于研究DNA与蛋白质互作的技术,通常用来分析目标基因调控区域相结合的转录因子及其他调控蛋白。针对目标区域设计脱硫生物素标记的特异性DNA探针,并与细胞核提取物孵育。

通过偶联磁珠,经洗脱,得到目的DNA探针-蛋白质复合物。最后采用Western Blot或质谱鉴定蛋白质类型。随着功能基因组学的兴起,蛋白质-DNA相互作用的研究变得越来越重要。蛋白质-DNA相互作用涉及很多生物学功能,如基因调节、DNA修复和DNA重组现有研究DNA-蛋白相互作用的技术方案有多种,如酵母单杂交(Y1H)方法、ChIP-seq方法、凝胶迁移实验(EMSA)和DNA pulldown方法。

DNA pulldown方法是一种非常重要的蛋白质-DNA相互作用的研究方法。该方法可以在同一个样品中分离DNA-蛋白复合体。通常,是通过高亲和性的标签(如生物素)标记DNA,标签的目的是固定DNA,通过琼脂糖珠子或磁珠可以分离出生物素化的DNA,从而分离出细胞裂解液中的DNA-蛋白复合体。分离出的蛋白进行洗脱后可以通过Western Blot进行检测,或通过质谱进行筛选。

步骤:

1、磁珠预处理:使用BSA(牛血清白蛋白)和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠;

2、制备探针‑磁珠复合物;

3、提取并预处理细胞核蛋白:向提取核蛋白样品中加入脱氧核糖核酸酶孵育,再加入磁珠孵育,去除磁珠,收集上清;

4、pulldown;

5、蛋白样品的收集。

产品特点:

1.快速省时:从标记探针到结果分析,全部实验只需3小时。

2.稳定可靠:DNA末端标记生物素,不影响蛋白结合位点。标记好的DNA可以保存一年。

3.配备完整:该试剂盒包括对照系统,只需要自备生物素末端标记的DNA探针及核蛋白质样品。

4.可得到完整、高浓度蛋白,用于质谱检测。

应用[8]

DNA pulldown试剂盒可用于基于荧光信号放大技术的蛋白质和核酸检测方法研究:

利用信号双重扩增(DNA扩增、SYBR Green I/BT-DNA结合物荧光信号扩增)结合磁分离技术,利用落射荧光显微术建立了一种超灵敏的靶蛋白荧光免疫测定方法。在高浓度时,荧光强度与靶抗原在5.0×10-13~8.0×10-15mol L-1的浓度对数范围内呈良好的线性关系。在低浓度时,一个功能化得磁纳米球对应一个蛋白分子,这时通过计数单个磁纳米球定量检测单个生物分子。

磁纳米球的数目和抗体的浓度在8.0×10-14~3.0×10-15mol L-1的范围内呈良好的线性关系。这个实验设计了一种哑铃型的RCA模版、将卟啉衍生物(NMM)与RCA的产物(双向G-四倍体DNA)相互作用,发展了一种快速、简便、高灵敏的基于哑铃型探针诱导RCA扩增辅助的G-四倍体免标记荧光信号放大策略超灵敏检测DNA。

参考文献

[1] ROHS R,JIN X,WEST S M,et al.2010.Origins of specificity in protein-DNA recognition.Annu Rev Biochem[J],79:233-269。

[2] An Autonomous Bio‐barcode DNA Machine for Exponential DNA Amplification and Its Application to the Electrochemical Determination of Adenosine Triphosphate[J].HuiZhang,CongcongFang,ShushengZhang.Chemistry–A European Journal.2010(41)

[3] Fluorescence single-molecule counting assays for protein quantification using epi-fluorescence microscopy with quantum dots labeling[J].Dafeng Jiang,Chunxia Liu,Lei Wang,Wei Jiang.Analytica Chimica Acta.2010(2)

[4] A Quadruplex‐Based,Label‐Free,and Real‐Time Fluorescence Assay for RNase?H Activity and Inhibition[J].DanHu,FangPu,ZhenzhenHuang,JinsongRen,XiaogangQu.Chemistry–A European Journal.2010(8)

[5] Ultrasensitive electrochemical immunoassay based on counting single magnetic nanobead by a combination of nanobead amplification and enzyme amplification[J].Jia Chen,Guizheng Zou,Xiaoli Zhang,Wenrui Jin.Electrochemistry Communications.2009(7)

[6] Chemiluminescence flow biosensor for hydrogen peroxide using DNAzyme immobilized on eggshell membrane as a thermally stable biocatalyst[J].Weiwei Chen,Baoxin Li,Chunli Xu,Lei Wang.Biosensors and Bioelectronics.2009(8)

[7] Rolling Circle Amplification:Applications in Nanotechnology and Biodetection with Functional Nucleic Acids[J].Angewandte Chemie International Edition.2008(34)

[8] 薛庆旺.基于荧光信号放大技术的蛋白质和核酸检测方法研究[D].山东大学,2012.

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