人恶性黑色素瘤细胞的应用

背景^[1-3]

人恶性黑色素瘤细胞是人恶性黑色素瘤细胞的一种。细胞源自人类皮肤，属于非整倍体肿瘤细胞系，通常用于研究黑色素瘤等人类皮肤肿瘤。

人恶性黑色素瘤细胞

人恶性黑色素瘤细胞使用说明：

1.人恶性黑色素瘤细胞株的复苏

a.将冻存管在37℃水浴锅中迅速完全融化(保持冻存管的盖子在液面以上以防止污染)，并适当轻轻摇晃促融，切勿vortex。快速、完全融化可以提高细胞的复苏效果。

b.打开冻存管前时用70%酒精擦拭细胞冻存管外壁，注意某些记号笔不耐酒精，小心标注的记号被擦拭掉。

c.将完全融化的细胞直接离心，或者转移至无菌1.5ml或其它合适无菌离心管中，500×g离心2-5min，吸除上清，注意不要吸走细胞沉淀，然后用新鲜完全培养液重悬后转移至培养器皿，混匀，置于CO2培养箱37℃培养。

d.第二天视贴壁或生长状态，更换培养液。

2.人恶性黑色素瘤细胞的常规传代流程

a.将细胞培养液、PBS等放入37℃水浴锅内预热。

b.以10cm细胞培养皿为例。吸出原培养皿中的培养液，用2-5ml无菌PBS润洗细胞1-2次以去除残留的血清(如果细胞贴壁较差，润洗时要轻柔以避免细胞飘起)，然后加1-2ml胰酶细胞消化液(含EDTA)室温消化，注意消化时间，通常为1-5分钟。如果细胞比较难消化，可以置于37℃细胞培养箱一定时间以加速消化。注意：消化时间过长，会导致传代后细胞出现生长状态不良的情况。

c.每30秒-1分钟用显微镜观察细胞消化情况，贴壁细胞明显收缩、细胞间间隙变大、细胞趋于圆形但还未漂起，并用移液器吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液，再加入1-2ml新鲜完全培养液，适当晃动细胞皿以终止胰酶作用，用移液器轻轻吹打贴壁的细胞，获取细胞悬液。吹打时需控制力度，避免产生大量气泡，将细胞悬液分别接种到另外的2~5个细胞培养皿内，加入新鲜培养液，置于CO2培养箱37℃培养，第2天观察细胞贴壁生长情况。

d.也可以在消化后，加3-5ml完全培养液终止消化，用移液器轻轻吹打细胞悬液，尽量把细胞全部吹落、吹散，然后将全部细胞悬液500×g离心2-5min，离心后去上清，再用完全培养液重悬后转移到新的培养皿中，添加适量完全培养液，于CO2培养箱37℃培养。

e.注意培养液的酚红颜色变化或根据细胞的换液要求定期换液，待细胞密度达到80-90%时需要传代或者冻存。如果没有及时传代导致细胞过密，传代后细胞容易出现生长状态不良的情况。

应用^[4-5]

人恶性黑色素瘤细胞可以用于β-catenin对恶性黑色素瘤细胞A375的增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响

恶性黑色素瘤是一种较常见的恶性肿瘤，好发于皮肤部，恶性程度高，平均生存期约30.3个月，且发病率呈逐年上升趋势。目前，治疗恶性黑色素瘤主要的手段有手术及抗肿瘤治疗（化疗、放疗、生物治疗），但其疗效均较差。

利用含有β-catenin特异序列RNA干扰慢病毒沉默β-catenin蛋白的表达，以此阻断Wnt/β-catenin信号转导通路，观察β-catenin沉默对恶性黑色素瘤A375细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响。

探讨通过沉默Wnt/β-catenin信号通路中的关键蛋白β-catenin，观察β-catenin对人恶性黑色素瘤细胞增殖、侵袭、迁移以及凋亡的影响，从而为恶性黑色素瘤的治疗提供依据。

方法：1.制作干扰慢病毒液：β-catenin-RNAi-LV(β-catenin干扰慢病毒液)和β-catenin-negative-LV(空载体慢病毒液)。分别感染人恶性黑色素瘤A375细胞，得到的稳定感染细胞株分别标记为A375-RNAi、A375-negative。采用Western Blot法检测感染后的A375-RNAi、A375-negative细胞中β-catenin蛋白表达水平，并以未感染的细胞作对照。

2. MTT法分别检测A375-RNAi、A375-negative细胞增殖能力，并以未感染的细胞作对照。

3. 采用细胞平板克隆形成实验检测A375-RNAi、A375-negative细胞平板克隆形成能力，并以未感染的细胞作对照。

4. 采用Transwell法检测A375-RNAi、A375-negative细胞体外趋化侵袭、迁移能力，并以未感染的细胞作对照。

5. 流式细胞术亚G1峰法检测A375-RNAi、A375-negative细胞的凋亡率，并以未感染的细胞作对照。

结果：1.Western Blot结果显示：β-catenin在人恶性黑色素瘤细胞中高表达，β-catenin在A375-RNAi细胞中的表达量下降，A375-RNAi细胞β-catenin蛋白的表达量较未感染的A375细胞下降约55.1%（P<0.05），证实β-catenin被β-catenin-RNAi-LV有效沉默；A375-negative细胞内β-catenin蛋白表达量与A375细胞无明显差异（P>0.05）。

2. MTT结果显示：A375-RNAi细胞与A375-negative细胞、A375细胞相比增殖活性均降低(P＜0.05)；A375-negative细胞较A375细胞增殖活性无明显差异（P＞0.05）。

3. 细胞平板克隆实验检测结果：A375-RNAi细胞与A375-negative细胞、A375细胞平板克隆形成能力相比均减低(P＜0.05)；A375-negative细胞较A375细胞平板克隆形成能力无明显差异（P＞0.05）。

4. Transwell结果显示：A375-RNAi细胞与A375-negative细胞、A375细胞侵袭、迁移能力相比均显著下降(P＜0.05)，A375-negative细胞较A375细胞的侵袭、迁移能力无明显差异（P＞0.05）。

5. 流式细胞术结果显示：A375-RNAi细胞与A375-negative细胞、A375细胞相比凋亡率明显增高(P＜0.05)；A375-negative细胞较A375细胞凋亡率无显著差异性(P＞0.05)。

结论：1.慢病毒载体介导siRNA能有效沉默人恶性黑色素瘤细胞内β-catenin蛋白的表达。

2.下调β-catenin表达能使人黑色素细胞瘤A375细胞增殖变缓，细胞克隆形成能力减弱，细胞侵袭、迁移能力下降，细胞凋亡率增加。β-catenin有望成为治疗人恶性黑色素瘤有效靶点。

参考文献

[1]Cancer statistics,2014.Rebecca Siegel;;Jiemin Ma;;Zhaohui Zou;;Ahmedin Jemal.CA A Cancer Journal for Clinicians,2014

[2]Altered expression of Krüppel-like factor 4 andβ-catenin in human gastriccancer.N.Zhang;;J.Zhang;;Z.W.Wang;;L.Zha;;Z.Huang.Oncology Letters,2012

[3]A Re-evaluation of the“Oncogenic”Nature of Wnt/β-catenin Signaling in Melanoma and Other Cancers.Olivia M.Lucero;;David W.Dawson;;Randall T.Moon;;Andy J.Chien.Current Oncology Reports,2010

[4]Defining the Conditions for the Generation of Melanocytes from Human Embryonic Stem Cells.DongFang;KimLeishear;Thiennga K.Nguyen;RenaFinko;KunCai;MizuhoFukunaga;LingLi;Patricia A.Brafford;Angela N.Kulp;XiaoweiXu;Keiran S.M.Smalley;MeenhardHerlyn.STEM CELLS,2009

[5]杨跃.β-catenin对恶性黑色素瘤细胞A375的增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响[D].南昌大学,2015.