胰蛋白酶溶液(1%)的应用

背景^[1-3]

胰蛋白酶溶液(1%)是一种常用的生物试剂，具有多种应用，比如在培养细胞或一些组织的消化过程中使用，它也可以被归类为细胞消化液。

在某些情况下，胰蛋白酶溶液(1%)可能是无菌的，经过滤除菌处理，但在其他情况下，它可能含有不同的浓度或成分。需要注意的是，使用胰蛋白酶溶液(1%)时应当遵循无菌操作，避免反复冻融等操作。

胰蛋白酶溶液(1%)

使用胰蛋白酶溶液（1%）进行细胞消化的步骤如下：

1.贴壁细胞的消化。吸除培养液，用无菌PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清。加入少量胰蛋白酶溶液(1%)略盖过细胞即可，室温放置,不同的细胞消化时间有所不同。

2.显微镜下观察，当细胞明显收缩并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显变化或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。

3.加入含血清的完全细胞培养液，吹打下细胞，即可直接用于后续实验。如果发现消化不足，则可以加入Trypsin solution重新消化。如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。

使用胰蛋白酶溶液（1%）进行组织消化的步骤如下：

1.将组织样本放入无菌的离心管中。

2.加入足够量的胰蛋白酶溶液（1%）以覆盖组织。

3.在37℃下孵育，直到组织完全消化。

4.用离心机以1000转/分钟的速度离心5分钟，收集上清液。用无血清培养液洗涤细胞一次以去除残余的血清。

5.用胰蛋白酶溶液（1%）重新悬浮细胞，然后加入含血清的完全细胞培养液终止消化。用离心机以1000转/分钟的速度离心5分钟，收集上清液。用无血清培养液洗涤细胞一次以去除残余的血清。

6.用胰蛋白酶溶液（1%）重新悬浮细胞，加入含血清的完全细胞培养液终止消化。用离心机以1000转/分钟的速度离心5分钟，收集上清液。用无血清培养液洗涤细胞一次以去除残余的血清。

7.用胰蛋白酶溶液（1%）重新悬浮细胞，加入含血清的完全细胞培养液终止消化。用离心机以1000转/分钟的速度离心5分钟，收集上清液。

应用^[4-5]

胰蛋白酶溶液(1%)可以用于红景天苷诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞以及治疗免疫性肝纤维化的体外、体内实验研究

MSCs的分离、培养及鉴定目的:优化大鼠MSCs体外分离、培养、扩增的有效方法,探讨其部分生物学特性以及分化潜能。

方法:在无菌条件下快速处死SD大鼠,收集骨髓细胞,快速悬浮于预冷的NH4Cl低渗盐溶液中裂解红细胞,离心去上清,收集沉淀的细胞,D-Hank’s充分洗涤后,用含10%的低糖型DMEM培养基进行扩增培养;传代时,采用胶原酶Ⅳ预先孵育1～2小时,再用胰蛋白酶溶液(1%)处理。倒置显微镜下观察细胞的一般形态结构;绘制生长曲线了解其生长特性;流式细胞学检测CD45、CD44、CD90等表面抗原的表达情况;用成骨、软骨以及脂肪方向分化的诱导液诱导MSCs向这三个方向分化,检测其多向分化潜能。

结果:原代培养的细胞接种4-6小时后有细胞贴壁,4～6天后细胞增殖速度明显增快,7～8天原代细胞汇合达80%-90%,原代及传代细胞形态学观察均成典型的成纤维样形态特征,旋涡状生长态势;传代培养的细胞在3天时增殖速度最快,5～6天时达到平台期;细胞可以连续传代20代而未见衰老现象,单个细胞可以扩增30倍左右。

流式细胞仪检测显示该细胞表达MSCs表面抗原CD44和CD90等,不表达造血系干细胞的表面抗原CD45等等;经过诱导后,MSCs可以分化为成骨细胞、骨细胞和脂肪细胞,显示了该细胞具有多向分化潜能。

结论:采用低渗盐溶液裂解红细胞,离心收集MSCs,再进行常规贴壁培养可以分离更为纯化的MSCs;在含10%FBS的低糖DMEM培养基中可稳定传代20代左右,细胞的性状没有发生改变;根据细胞鉴定结果,该细胞具有以下特征:贴附塑料器皿生长的特性;表达MSCs特殊的表面抗原如CD44、CD90等;不表达造血系细胞的表面抗原如CD45等;具有向成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞等胚层细胞方向分化的能力。所以,该细胞是MSCs;结合低渗裂解红细胞及常规贴壁培养方法,使得分离、培养及扩增MSCs更为方便。

参考文献

[1]Wnt signaling controls the fate of mesenchymal stem cells.Ling Ling;;Victor Nurcombe;;Simon M.Cool.Gene,2008

[2]Locally Overexpressing Hepatocyte Growth Factor Prevents Post-ischemic Heart Failure by Inhibition of Apoptosis via Calcineurin-mediated Pathway and Angiogenesis.Yinghua Guo;;Jianguo He;;Junlou Wu;;Long Yang;;Shimo Dai;;Xiaoyan Tan;;Lirong Liang.Archives of Medical Research,2008

[3]Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.Kazutoshi Takahashi;;Koji Tanabe;;Mari Ohnuki;;Megumi Narita;;Tomoko Ichisaka;;Kiichiro Tomoda;;Shinya Yamanaka.Cell,2007

[4]Immunomodulation of activated hepatic stellate cells by mesenchymal stem cells..Biochemical and Biophysical Research Communications,2007

[5]欧阳竞锋.红景天苷诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞以及治疗免疫性肝纤维化的体外、体内实验研究[D].浙江大学,2009.