柏氏巴贝斯虫PCR试剂盒的应用

背景^[1-3]

柏氏巴贝斯虫PCR试剂盒适用于检测血液中的巴贝斯虫，用于巴贝斯虫感染的辅助诊断,仅科研。本试剂盒采用TaqMan探针法实时荧光PCR技术，设计一对巴贝斯虫基因组特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光PCR技术对巴贝斯虫基因组的DNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

巴贝斯虫病是一种蜱传性的血液原虫病，该病由寄生于红细胞内的多种巴贝斯虫引起，其临床特征为发热、精神沉郁、嗜睡、黄疸、贫血、血红蛋白尿、呕吐、呼吸困难等，对健康造成了巨大的危害。

柏氏巴贝斯虫PCR试剂盒

柏氏巴贝斯虫PCR试剂盒使用步骤：

1样本制备

1.1：组织样品：每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1g，手术剪剪碎混匀后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中；咽拭子样品直接取100μL于1.5mL灭菌离心管中。

1.2推荐采用核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请按照试剂说明书进行操作。

2.根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照；样品每满10份，多配制1份)，每测试反应体系配制如下表：试剂Bab反应液酶液用量（样本数为N）20μL 1μL将混合好的测试反应液分装到PCR反应管中，21uL/管。

3.将步骤1提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4.PCR反应设置

4.1将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内；

4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为25μL；

应用^[4-5]

柏氏巴贝斯虫PCR试剂盒可以用于犬吉氏巴贝斯虫PCR方法的建立及其临床病理学变化的研究

建立了含扩增内标的犬巴贝斯虫PCR检测方法,在准确诊断的基础上,然后监测人工感染巴贝斯虫后病犬临床病理学指标的变化,同时研究了脾脏切除对犬巴贝斯虫病影响,为临床犬巴贝斯虫病的诊治提供理论依据。

1. 含扩增内标犬巴贝斯虫PCR检测方法的建立为有效避免临床PCR检测过程中巴贝斯虫检测结果的假阴性,本试验通过在犬巴贝斯虫PCR检测体系中加入扩增内标,建立含扩增内标的犬巴贝斯虫PCR检测方法。同时使用商品化的柏氏巴贝斯虫PCR试剂盒作为对照。

试验中利用鸡的基因片段采用复合引物重组方法构建扩增内标质粒,该扩增内标含有与犬巴贝斯虫PCR具有检测相同的引物。

结果显示在25μL反应体系中加入扩增内标106 copies犬巴贝斯虫PCR检测灵敏度为105 copies/25μL反应体系。本试验建立的含扩增内标的PCR检测方法能快速、准确、简便的检测犬巴贝斯虫感染,同时能有效的避免假阴性现象的产生。

2. 人工感染犬吉氏巴贝斯虫后临床病理学变化本试验通过静脉感染含犬吉氏巴贝斯虫血液,感染后监测体温变化、血涂片、血常规和血液生化等临床病理学指标的变化。采集血液,PCR检测犬吉氏巴贝斯虫感染是否成功;结果显示感染后9天PCR能检测到血液中的巴贝斯虫基因片段;感染后犬的体温升高;临床指标显示严重贫血、红细胞计数下降、血红蛋白减少、中性粒细胞减少、淋巴细胞升高,血小板减少。同时甘油三酯、总胆固醇和LDH、ALP升高,肌酸激酶升高,血钾升高,血糖减少,血钠、血氯降低;本试验中实验犬在感染27天、30天分别死1只。上述结果表明犬吉氏巴贝斯虫感染后造成心脏、肝脏,肾脏功能的严重损伤。

3. 脾脏切除对犬巴贝斯虫病的影响本试验为研究脾脏在犬巴贝斯虫病中的作用,分为三组,A组感染痊愈后切除脾脏,B组感染中出现严重黄疸,染虫率低于1%时切除脾脏,C组感染不切除脾脏,监测体温、血常规和血液生化的变化。结果显示感染痊愈后切除脾脏犬的染虫率不高,而感染中出现严重黄疸、贫血时切除脾脏的犬染虫率上升。

切除脾脏使贫血的情况加剧,且感染中出现黄疸和严重贫血时切除脾脏红细胞下降的更多;血小板有短暂的升高,之后下降的更厉害。感染中出现严重黄疸,染虫率低于1%切脾组尿素氮切除脾脏后有所上升,切除脾脏组均出现轻度的肾衰竭。感染中出现黄疸、染虫率低于1%切除脾脏组总胆红素、直接胆红素、谷丙转氨酶和谷草转氨酶在感染第21天升高。切脾组较感染未切脾组甘油三酯、乳酸脱氢酶、肌酸激酶升高较多,胆固醇下降的较多。切除脾脏组血糖降低较未切除脾脏组下降更多。对血钠、血氯、血钙的影响不大。

参考文献

[1]Presence of Candidatus Neoehrlichia mikurensis and Babesia microti in rodents and two tick species(Ixodes ricinus and Ixodes trianguliceps)in Slovakia.Lucia Blaňarová;;Michal Stanko;;Dana Miklisová;;Bronislava Víchová;;Ladislav Mo?ansky;;Jasna Kraljik;;Martin Bona;;Markéta Derdáková.Ticks and Tick-borne Diseases,2015

[2]Design of an internal amplification control for a duplex PCR used in the detection of Shiga toxin producing Escherichia coli in pediatric feces.ángel Gabriel Salinas-Ibá?ez;;Cecilia Lucero-Estrada;;Constanza Chialva;;Juan Manuel Zárate;;Maximiliano Juri-Ayub;;María Esther Escudero.Molecular and Cellular Probes,2015

[3]Epidemiology and molecular phylogeny of Babesia sp.in Little Penguins Eudyptula minor in Australia.Ralph Eric Thijl Vanstreels;;Eric J.Woehler;;Valeria Ruoppolo;;Peter Vertigan;;Nicholas Carlile;;David Priddel;;Annett Finger;;Peter Dann;;Kimberly Vinette Herrin;;Paul Thompson;;Francisco C.Ferreira Junior;;érika M.Braga;;Renata Hurtado;;Sabrina Epiphanio;;JoséLuiz Cat?o-Dias.International Journal for Parasitology:Parasites,2015

[4]Molecular detection and genetic diversity of Babesia gibsoni in dogs in Bangladesh.Masashi Terao;;Shirin Akter;;Md.Golam Yasin;;Ryo Nakao;;Hirotomo Kato;;Mohammad Zahangir Alam;;Ken Katakura.Infection,Genetics and Evolution,2015

[5]杨伦.犬吉氏巴贝斯虫PCR方法的建立及其临床病理学变化的研究[D].南京农业大学,2018.