小鼠主动脉外膜成纤维细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠主动脉外膜成纤维细胞分离自主动脉血管外膜组织采用胰蛋白酶-胶原酶混合酶消化后差速贴壁制备而来。分离的小鼠主动脉外膜成纤维细胞经Vimentin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

血管外膜是由疏松结缔组织组成，其中含螺旋状或纵向分布的弹性纤维和胶原纤维。血管壁的结缔组织细胞以成纤维细胞为主，当血管受损伤时，成纤维细胞具有修复外膜的能力。有的动脉中膜和外膜的交界处，有密集的弹性纤维组成的外弹性膜。

成纤维细胞（Fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质嗜弱碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化；成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损的修复有着十分重要的作用。

刚分离的血管外膜成纤维细胞呈圆形、折光性良好，悬浮于培养基中。30min细胞贴壁，其中部分开始伸出伪足，表现为小的突起；6h后细胞基本贴壁完全，伸展成梭形，胞核清晰，分布较均匀，散在生长，不聚集成团；细胞生长迅速，5-7天即呈融合状态，细胞排列紧密，有的交叉重叠生长，平坦、胞体较大，细胞质透明，细胞核较大，呈椭圆形，颜色淡。

小鼠主动脉外膜成纤维细胞

小鼠主动脉外膜成纤维细胞使用方法

小鼠主动脉外膜成纤维细胞是一种贴壁细胞，细胞形态呈成纤维细胞样，细胞可传1-2代左右；建议您收到细胞后尽快进行相关实验。收到细胞后，请按照以下方法进行操作。

1.取出T25细胞培养瓶，用75%酒精消毒瓶身，拆下封口膜，放入37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置3-4h，以稳定细胞状态。

2.贴壁细胞消化

1)吸出T25细胞培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；

2)添加0.25%胰蛋白酶消化液1mL至T25培养瓶中，轻微转动培养瓶至消化液覆盖整个培养

瓶底后，吸出多余胰蛋白酶消化液，37℃温浴1-3min；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变

圆后，再加入5ml完全培养基终止消化；

3)用吸管轻轻吹打混匀，按传代比例接种T25培养瓶传代，然后补充新鲜的完全培养基至5

mL，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养；

4)待细胞完全贴壁后，培养观察；之后按照换液频率更换新鲜的完全培养基。

3.细胞实验

因原代细胞贴壁特殊性，贴壁的原代细胞在消化后转移至其他实验器皿（如玻璃爬片、培

养板、共聚焦培养皿等）时，需要对实验器皿进行包被，以增强细胞贴壁性，避免细胞因

没贴好影响实验；包被条件常选用鼠尾胶原Ⅰ（2-5μg/cm2），多聚赖氨酸PLL（0.1mg/ml

），明胶（0.1%），依据细胞种类而定。悬浮/半悬浮细胞无需包被。

应用^[4-5]

小鼠主动脉外膜成纤维细胞可以用于大动脉炎患者中LILRA3基因多态性,外周血中IL-25/IL-17RB的表达及其对LPS诱导的小鼠血管外膜成纤维细胞功能影响的研究

研究大动脉炎患者外周血中IL-25和IL-17RB的表达情况,研究IL-25/IL-17RB对LPS诱导的小鼠血管外膜成纤维细胞的增殖、迁移和凋亡的作用,以及对炎症因子的影响。

方法:1.外周血中IL-25和IL-17RB蛋白水平的检测:收集47例确诊的TAK患者、血管炎疾病对照组(12例ANCA相关性血管炎患者、16例BD患者)和55例健康对照外周血,采用ELISA检测TAK患者和HC血清中的IL-25和IL-17RB蛋白水平。分析IL-25和IL-17RB与TAK血管分型及炎性指标(ESR、CRP)的相关性。

2. 炎症模型的建立:设立空白组和不同的LPS浓度(0.01μg/m L,0.1μg/m L,1μg/m L,5μg/m L,10μg/m L,100μg/m L,200μg/m L),通过CCK-8法检测AF细胞的活性,确定干预浓度。通过PCR检测IL-6的m RNA水平确定造模是否成功。

3. 体外实验:购买小鼠主动脉外膜成纤维细胞(原代细胞),实验分组为正常组,不同干预组(LPS组,LPS+IL-25组,LPS+IL-17组,LPS+IL-25+IL-17组),IL-17RB-si RNA转染后干预组(si RNA+LPS组,si RNA+LPS+IL-25组)。

4. si RNA转染实验:设计合成IL-17RB的小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA),通过si RNA-mate转染试剂将si RNA转移至AF中。本实验中设置健康对照组和IL-17RB干扰组(si RNA组)。使用q RCR检测IL-17RB的抑制情况,筛选出干扰率最高的si RNA进行后续实验。

5. 细胞增殖、迁移和凋亡的检测方法:

(1) CCK8法检测实验组以及对照组细胞的增殖活性情况,采用流式细胞术对细胞凋亡进行检测,采用细胞划痕法检测各组小鼠血管外膜成纤维细胞的迁移能力的情况;

(2) 采用ELISA检测MMP2和9、MCP-1、TGF-β1炎症因子的表达。通过q PCR检测α-SMA炎症因子的表达。

结果:1.大动脉炎患者外周血中IL-17RB和IL-25蛋白水平的分析:与健康对照组、血管炎疾病对照相比,大动脉炎患者外周血中的IL-17RB蛋白水平增加(P<0.05)。与健康对照组相比,大动脉炎、ANCA相关性血管炎和白塞病中,IL-25蛋白水平升高(P<0.05)。

2. 大动脉炎患者外周血中IL-17RB和IL-25蛋白水平与血管分型的相关性:大动脉炎患者外周血中IL-17RB蛋白水平与大动脉炎的血管分型有关(P<0.05);IL-25蛋白水平升高与大动脉炎的血管分型无相关性(P>0.05)。

3.大动脉炎患者外周血中IL-17RB和IL-25蛋白水平与ESR、CRP的相关性分析:IL-17RB蛋白水平与ESR有相关性(P<0.05)。IL-17RB蛋白水平与CRP无相关性(P>0.05)。IL-25蛋白水平与ESR、CRP的无相关性(P>0.05)。

参考文献

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[2]Interleukin-25:New perspective and state-of-the-art in cancer prognosis and treatment approaches..Gowhari Shabgah Arezoo;Amir Azwar;Gardanova Zhanna R;Olegovna Zekiy Angelina;Thangavelu Lakshmi;Ebrahimi Nik Maryam;Ahmadi Majid;Gholizadeh Navashenaq Jamshid.Cancer medicine,2021

[3]Serum C1q concentration is associated with disease activity in Chinese Takayasu arteritis patients:A case‐control study.Si Chen;Haixia Luan;Jianxun He;Yan Wang;Xiaoli Zeng;Yongzhe Li;Hui Yuan.Health Science Reports,2021

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[5]韩云霞.大动脉炎患者中LILRA3基因多态性,外周血中IL-25/IL-17RB的表达及其对LPS诱导的小鼠血管外膜成纤维细胞功能影响的研究[D].山西医科大学,2023.