大鼠睾丸间质细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠睾丸间质细胞是一种用于研究和治疗男性生殖系统的细胞。

这些细胞来源于大鼠的睾丸间质组织，具有一些特征性的生物学特性，如梭形细胞形态、不规则细胞样、贴壁生长等。大鼠睾丸间质细胞可以用于研究男性生殖系统的生理和病理过程，如激素调节、精子发生和生殖细胞的分化等。

此外，大鼠睾丸间质细胞还可以用于制作男性生殖系统模型，以模拟生理和病理条件下的生殖系统功能。这些模型对于研究男性生殖系统的生物学、探索新的治疗策略以及开发药物和疫苗等都具有重要的意义。

大鼠睾丸间质细胞

大鼠睾丸间质细胞培养步骤：

一．大鼠睾丸间质细胞培养基及培养冻存条件准备：

1)准备：DMEM+10%FBS+1%P/S

2)培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3)冻存液：50%basal medium+40%FBS+10%DMSO。

二．大鼠睾丸间质细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

注：次传代推荐传代比例为1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。

3）大鼠睾丸间质细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

1．细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2．1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。明舟生物（mingzhoubio）按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。

3．将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

大鼠睾丸间质细胞可以用于成纤维细胞生长因子对大鼠睾丸间质细胞增殖、分化及雄激素合成的调控研究

分析成纤维细胞生长因子对大鼠睾丸间质细胞增殖、分化及雄激素合成的调控,为了解成纤维细胞生长因子对睾丸间质细胞谱系的发育及治疗性腺功能减退等疾病提供初步的治疗依据。

方法:利用Percoll密度梯度离心的方法,从出生后35天SD大鼠中分离出大鼠原代ILC,贴壁处理4小时后,用终浓度为10 ng/ml和100 ng/ml FGFs分别处理细胞48小时。利用高内涵显微镜分析ILCs细胞增殖情况并进行细胞计数;利用ELISA方法测各因子处理组培养基中上清雄激素含量。此外,利用相同的密度梯度方法,从出生90天的SD大鼠中分离出ALCs,用终浓度为10 ng/ml和100 ng/ml FGFs分别处理细胞24小时,ELISA方法测各因子处理组培养基中上清雄激素含量。最后结合以上数据用统计软件作图分析。

结果:在调控ILCs增殖方面,LH可调控ILCs往ALCs增殖分化,因为ILCs向ALCs分化过程中只增殖一次,所以与阴性对照组相比,LH处理组中细胞数量并没有显著的增加。FGF19可促进ILC增殖,以10 ng/ml FGF19组最显著,约为阴性对照组相的1.19倍。而FGF1、FGF9、FGF10可抑制ILC增殖,具有细胞毒性的作用,且呈剂量依赖性。

其中,FGF10处理组最为显著,10 ng/ml和100 ng/ml处理组的细胞数量分别约为对照组的65.07%和32.57%。上述表明FGFs可调控ILCs增殖。

在调控ILCs分化方面,(1)FGF1、FGF6、FGF8b能有显著促ILCs合成睾酮,其中FGF1最显著,10 ng/ml和100 ng/ml处理组睾酮量约为阴性对照组的3.42和3.66倍,这些结果表明,FGF1、FGF6、FGF8b具有促ILCs分化的功能。其余因子组均无显著抑制ILCs分化的功能。

(2) 加入10 ng/ml LH诱导3小时后发现FGF5、FGF7、FGF20、FGF22显著促进ILCs合成睾酮,其中FGF20最显著,10 ng/ml和100 ng/ml处理组睾酮量分别约为阴性对照组的2.49和3.60倍。表明在LH的诱导下FGF20能更好的促ILCs分化。而FGF9在LH的诱导下呈双向调节作用即低浓度时促进ILCs合成睾酮,而高浓度时则展示抑制。

上述表明FGFs和LH可共同调控ILCs合成雄激素。在调控ALCs合成雄激素方面,(1)与阴性对照组产生睾酮含量相比,在因子中100 ng/ml FGF1、FGF17、FGF22均促进ALCs合成睾酮,FGF1最显著,为对照组的约1.58倍;FGF5、FGF6、FGF16、FGF20、FGF21均能够抑制ALCs合成雄激素,其中FGF5最显著,10 ng/ml和100 ng/ml组睾酮含量分别为对照组的约26.26%、56.50%;(2)加入100 ng/ml LH诱导3小时后发现,与阴性对照组相比,FGF1、FGF2、FGF4、FGF6、FGF9、FGF16、FGF18、FGF21均可促进ALCs合成雄激素,其中100 ng/ml FGF1最显著,为阴性对照组的睾酮量的约2.94倍。FGF7、FGF17可抑制ALCs合成雄激素,以100 ng/ml FGF17最显著,为对照组的约41.75%

参考文献

[1]The Fgf8 subfamily(Fgf8,Fgf17 and Fgf18)is required for closure of the embryonic ventral body wall..Boylan Michael;Anderson Matthew J;Ornitz David M;Lewandoski Mark.Development(Cambridge,England),2020

[2]FGF6 enhances muscle regeneration after nerve injury by relying on ERK1/2 mechanism.Qiuchen Cai;;Genbin Wu;;Min Zhu;;Heng'’an Ge;;Chao Xue;;Qing'’gang Zhang;;Biao Cheng;;Sudan Xu;;Peng Wu.Life Sciences,2020

[3]FGF18 Inhibits Clear Cell Renal Cell Carcinoma Proliferation and Invasion via Regulating Epithelial-Mesenchymal Transition..Yang Chen;Zhang Zheyu;Ye Fangdie;Mou Zezhong;Chen Xinan;Ou Yuxi;Xu Chenyang;Wu Siqi;Cheng Zhang;Hu Jimeng;Zou Lujia;Jiang Haowen.Frontiers in oncology,2020

[4]The value of FGF9 as a novel biomarker in the diagnosis of prostate cancer..Cui Genggang;Shao Mingming;Gu Xingzhou;Guo Hongbo;Zhang Shiqing;Lu Jianlei;Ma Hongbin.Artificial cells,nanomedicine,and biotechnology,2019

[5]李晓.成纤维细胞生长因子对大鼠睾丸间质细胞增殖、分化及雄激素合成的调控研究[D].暨南大学,2022.