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大肠杆菌表达系统

发布日期:2020/1/9 8:40:58

背景[1-7]

大肠杆菌属于大肠菌群属兼性厌氧革兰氏阴性菌,大肠杆菌是通常生活在生物肠道中。大多数大肠杆菌菌株是无害的,但某些血清型可导致宿主严重的食物中毒。

无害大肠杆菌是肠道正常微生物群的一部分与生物体为共生关系,可以通过产生维生素K 2使机体受益,并防止病原菌在肠道增殖。大肠杆菌是个用于重组蛋白生产的宿主菌,它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉,可以快速大规模地生产目的蛋白等优点,而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统,表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的30%,因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。

大肠杆菌是最广泛使用的表达宿主之一,并且DNA通常被引入质粒表达载体中。在大肠杆菌中过表达的技术已得到很好的发展,并且通过增加基因拷贝数或增加启动子区的结合强度来起作用,从而有助于转录。

例如,可以将目的蛋白质的DNA序列克隆或亚克隆到含有lac启动子的高拷贝数质粒中,然后将其转化到细菌大肠杆菌中。添加IPTG(乳糖类似物)激活lac启动子并使细菌表达目的蛋白质。

组成[1-7]

大肠杆菌表达系统优点培养周期短,目标基因表达水平高,遗传背景清楚,是目前应用最为广泛的蛋白表达系统涵盖病毒蛋白,兽用疫苗,植物及水产研究用蛋白,细胞因子,酶类等方面。大肠杆菌表达系统的组成:表达载体、外源基因、表达宿主菌。

1.表达载体:

小型环状DNA,能自我复制。一个完整的质粒载体必须要有复制起点、启动子、插入的目的基因、筛选标记以及终止子;此外对大肠杆菌表达载体的要求是:①操纵子以及相应的的调控序列,外源基因产物可能会对大肠杆菌有毒害作用;②SD序列,即核糖体识别序列,一般SD序列与起始密码子之间间隔7-13bp翻译效率最高;③多克隆位点以便目的基因插入到适合位置。

2.外源基因:

在大肠杆菌表达体系中要表达的基因即外源基因,包括原核基因和真核基因;原核基因可以在大肠杆菌中直接表达出来,但是真核基因韩有内含子不能,大肠杆菌不能对mRNA进行剪切,从而形成成熟的mRNA,所以真核基因一般以cDNA的形式在大肠杆菌表达系统中表达。此外还需提供大肠杆菌能识别的且能转录翻译真核基因的元件。

3.表达宿主菌:

表达蛋白的生物体即大肠杆菌。表达宿主菌的选择在大肠杆菌蛋白表达过程中是很重要的因素——多数人会直接选择实验室曾经用过的宿主菌,而不去追究原因。对于宿主菌的选择主要根据宿主菌各自的特征及目的蛋白的特性,例如目的蛋白需要形成二硫键,可以选择Origami 2系列,Origami能显著提高细胞质中二硫键形成几率,促进蛋白可溶性及活性表达;目的蛋白含有较多稀有密码子可用Rosetta 2系列,补充大肠杆菌缺乏的七种(AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA及CGG)稀有密码子对应的tRNA,提高外源基因的表达水平。

应用[8]

人乳头瘤病毒18型病毒样颗粒在大肠杆菌中的表达及免疫原性分析:利用大肠杆菌表达系统可溶性表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,经过纯化和重组装过程获得HPV18病毒样颗粒(VLPs),研究其免疫原性和诱发中和抗体生成的水平。

首先,提取HPV18的基因组DNA,通过PCR扩增获得HPV18 L1基因片段,将其插入pTrxFus表达载体,在大肠杆菌中可溶性表达HPV18 L1蛋白;其次,通过硫酸铵沉淀、离子交换层析和疏水相互作用层析获得高纯度的HPV18 L1蛋白,而后透析去除预先加入的还原剂DTT,使HPV18 L1蛋白自发组装成VLPs;最后,通过动态光散射技术和透射电子显微镜鉴定HPV18 VLPs的大小和形态,利用假病毒细胞中和实验评价HPV18 VLPs在实验动物体内的免疫原性和中和抗体生成水平。

结果表明,HPV18L1蛋白可以在大肠杆菌表达系统中以可溶形式表达,经过纯化的HPV18 L1蛋白可以自发组装成为半径约为29.34nm、与HPV病毒外观相似的VLP。该VLPs在小鼠体内的中和抗体半数有效剂量为0.006μg,在兔及山羊体内诱导中和抗体滴度高达107。总之,本研究利用原核表达系统可简便高效地获得具有高度免疫原性的HPV18 VLPs,为HPV18预防性疫苗的开发奠定了基础,具有重要的应用意义。

参考文献

[1] Wells,J.C.(2000)Longman Pronunciation Dictionary.Harlow[England],Pearson Education Ltd.

[2] Tenaillon O,Skurnik D,Picard B,Denamur E(March 2010)."The population genetics of commensal Escherichia coli".Nature Reviews.Microbiology.8(3):207–17.

[3] Singleton P(1999).Bacteria in Biology,Biotechnology and Medicine(5th ed.).Wiley.pp.444–454.ISBN 978-0-471-98880-9.

[4] "Escherichia coli".CDC National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases.Retrieved 2 October 2012.

[5] Vogt RL,Dippold L(2005)."Escherichia coli O157:H7 outbreak associated with consumption of ground beef,June-July 2002".Public Health Reports.120(2):174–8.

[6] Bentley R,Meganathan R(September 1982)."Biosynthesis of vitamin K(menaquinone)in bacteria".Microbiological Reviews.46(3):241–80.PMC 281544.PMID 6127606.

[7] Hudault S,Guignot J,Servin AL(July 2001)."Escherichia coli strains colonising the gastrointestinal tract protect germfree mice against Salmonella typhimurium infection".Gut.49(1):47–55.

[8] 谢明辉,李少伟,沈文通,李仲艺,庄玉娣,莫小兵,顾颖,吴婷,张军,夏宁邵.人乳头瘤病毒18型病毒样颗粒在大肠杆菌中的表达及免疫原性分析[J].生物工程学报,2009,25(07):1082-1087.

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