大肠杆菌表达系统

背景^[1-7]

大肠杆菌属于大肠菌群属兼性厌氧革兰氏阴性菌，大肠杆菌是通常生活在生物肠道中。大多数大肠杆菌菌株是无害的，但某些血清型可导致宿主严重的食物中毒。

无害大肠杆菌是肠道正常微生物群的一部分与生物体为共生关系，可以通过产生维生素K 2使机体受益，并防止病原菌在肠道增殖。大肠杆菌是个用于重组蛋白生产的宿主菌,它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉,可以快速大规模地生产目的蛋白等优点,而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统,表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的30%,因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。

大肠杆菌是最广泛使用的表达宿主之一，并且DNA通常被引入质粒表达载体中。在大肠杆菌中过表达的技术已得到很好的发展，并且通过增加基因拷贝数或增加启动子区的结合强度来起作用，从而有助于转录。

例如，可以将目的蛋白质的DNA序列克隆或亚克隆到含有lac启动子的高拷贝数质粒中，然后将其转化到细菌大肠杆菌中。添加IPTG（乳糖类似物）激活lac启动子并使细菌表达目的蛋白质。

组成^[1-7]

大肠杆菌表达系统优点培养周期短，目标基因表达水平高，遗传背景清楚，是目前应用最为广泛的蛋白表达系统涵盖病毒蛋白，兽用疫苗，植物及水产研究用蛋白，细胞因子，酶类等方面。大肠杆菌表达系统的组成：表达载体、外源基因、表达宿主菌。

1.表达载体：

小型环状DNA，能自我复制。一个完整的质粒载体必须要有复制起点、启动子、插入的目的基因、筛选标记以及终止子；此外对大肠杆菌表达载体的要求是：①操纵子以及相应的的调控序列，外源基因产物可能会对大肠杆菌有毒害作用；②SD序列，即核糖体识别序列，一般SD序列与起始密码子之间间隔7-13bp翻译效率最高；③多克隆位点以便目的基因插入到适合位置。

2.外源基因：

在大肠杆菌表达体系中要表达的基因即外源基因，包括原核基因和真核基因；原核基因可以在大肠杆菌中直接表达出来，但是真核基因韩有内含子不能，大肠杆菌不能对mRNA进行剪切，从而形成成熟的mRNA，所以真核基因一般以cDNA的形式在大肠杆菌表达系统中表达。此外还需提供大肠杆菌能识别的且能转录翻译真核基因的元件。

3.表达宿主菌：

表达蛋白的生物体即大肠杆菌。表达宿主菌的选择在大肠杆菌蛋白表达过程中是很重要的因素——多数人会直接选择实验室曾经用过的宿主菌，而不去追究原因。对于宿主菌的选择主要根据宿主菌各自的特征及目的蛋白的特性，例如目的蛋白需要形成二硫键，可以选择Origami 2系列，Origami能显著提高细胞质中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达；目的蛋白含有较多稀有密码子可用Rosetta 2系列，补充大肠杆菌缺乏的七种（AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA及CGG）稀有密码子对应的tRNA，提高外源基因的表达水平。

应用^[8]

人乳头瘤病毒18型病毒样颗粒在大肠杆菌中的表达及免疫原性分析：利用大肠杆菌表达系统可溶性表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,经过纯化和重组装过程获得HPV18病毒样颗粒(VLPs),研究其免疫原性和诱发中和抗体生成的水平。

首先,提取HPV18的基因组DNA,通过PCR扩增获得HPV18 L1基因片段,将其插入pTrxFus表达载体,在大肠杆菌中可溶性表达HPV18 L1蛋白;其次,通过硫酸铵沉淀、离子交换层析和疏水相互作用层析获得高纯度的HPV18 L1蛋白,而后透析去除预先加入的还原剂DTT,使HPV18 L1蛋白自发组装成VLPs;最后,通过动态光散射技术和透射电子显微镜鉴定HPV18 VLPs的大小和形态,利用假病毒细胞中和实验评价HPV18 VLPs在实验动物体内的免疫原性和中和抗体生成水平。

结果表明,HPV18L1蛋白可以在大肠杆菌表达系统中以可溶形式表达,经过纯化的HPV18 L1蛋白可以自发组装成为半径约为29.34nm、与HPV病毒外观相似的VLP。该VLPs在小鼠体内的中和抗体半数有效剂量为0.006μg,在兔及山羊体内诱导中和抗体滴度高达107。总之,本研究利用原核表达系统可简便高效地获得具有高度免疫原性的HPV18 VLPs,为HPV18预防性疫苗的开发奠定了基础,具有重要的应用意义。

参考文献

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