Ac-VEID-pNA(Caspase 6显色底物)

背景^[1-7]

Ac-VEID-pNA(Caspase 6显色底物)是采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中caspase 6酶活性或纯化的caspase 6酶活性的显色底物。

原理：caspase 6可以催化底物Ac-VEID-pNA(acetyl-Val-Glu-Ilel-Asp p-nitroanilide)产生黄色的pNA(p-nitroaniline)，从而可以通过测定吸光度来检测caspase 6的活性。pNA在405nm附近有强吸收。Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase 6也称Mch-2，有时被写作caspase-6或caspase 6，最初从人的Jurkat细胞中被发现。

Caspase 6的前体被granzyme B剪切后可以形成活化的caspase 6二聚体，而活化的caspase 6被发现可以诱导细胞凋亡。Caspase 6可以剪切PARP和keratin-18，也可以剪切细胞核核被膜上的关键组成蛋白Lamin A。Caspase家族中仅caspase 6可以剪切Lamin A。Caspase 6对于Lamin A的识别位点是VEID。Caspase 6在人中由编码CASP6基因。

已在许多哺乳动物中鉴定出CASP6直向同源物，其中有完整的基因组数据。独特的直系同源物也存在于鸟类，蜥蜴，lissamphibians和硬骨鱼类中。胱天蛋白酶6已经公知的函数的细胞凋亡，早期免疫应答和神经变性在亨廷顿和阿尔茨海默氏病。该基因编码的蛋白质是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶（caspase）家族的成员。半胱氨酸蛋白酶的顺序激活在细胞凋亡的执行阶段起着重要作用。

半胱天冬酶作为无活性的酶原存在，在保守的天冬氨酸残基上进行蛋白水解加工，产生两个大小的亚基，它们二聚化形成活性酶。该蛋白质是由处理胱天蛋白酶7，8和10并且被认为在半胱天冬酶激活级联中起到下游酶的作用。Caspase 6也可以在没有caspase家族其他成员的情况下进行自我处理。该基因的可变剪接导致编码不同同种型的两种转录物变体。

Caspase-6通过去抑制在早期免疫反应中起作用。它降低免疫抑制剂细胞因子白细胞介素-10的表达并切割抑制IRAK-M的巨噬细胞。关于神经变性，caspase-6在亨廷顿氏病和阿尔茨海默病的APP中切割HTT。导致两种情况下片段的蛋白质聚集。

研究应用^[8]

Ac-VEID-pNA(Caspase 6显色底物)可用于研究DR6与Caspase6在PrP106-126诱导大鼠脊髓神经元轴突变性过程中的调控机制。prp106-126诱导的大鼠脊髓神经元轴突变性神经元的分子机制,探索死亡受体6在轴突变性中的作用以及其下游的激活机制。结果表明：

1.脊髓神经元在毒性多肽PrP106-126作用下,脊髓神经元的细胞骨架严重受损,神经元轴突大量消失,轴突远端微管出现断裂,微管蛋白聚集明显。表明神经元在PrP106-126作用下,通过破坏细胞内微管结构导致神经元轴突发生变性。

2.脊髓神经元在PrP106-126作用下,在神经元轴突发生变性,在神经元大量死亡的同时,细胞内死亡受体6蛋白水平显著增高。对神经元DR6进行敲除后,可以很好的阻止神经元由于毒性多肽PrP106-126引起的轴突变性。我们证明DR6对脊髓神经元轴突变性存在决定性的调控作用。

3.脊髓神经元在PrP106-126作用下,细胞内Caspase3、Caspase6被激活。Caspase3在神经元胞体大量表达,轴突内几乎无表达；Caspase6在神经元轴突和胞体大量表达。将Caspase3、Caspase6抑制后,在PrP106-126作用下,Caspase3被抑制组的神经元胞体基本完整但轴突发生明显变性,Caspase6被抑制组的神经元胞体与轴突都较为完整。Caspase3、Caspase6的SiRNA结果与抑制效果相同。结果表明,在PrP106-126作用下,Caspase6对脊髓神经元轴突发生变性起调节作用。

4.在DR6被干扰后,神经元的Caspase6激活也会受到抑制；PrP106-126作用于DR6干扰组神经元也未出现Caspase6激活的现象,相似的,DR6干扰的存在也会抑制神经元Caspase3的激活。结果表明：caspase6的细胞凋亡信号调控通路位于DR6的下游,DR6和Caspase6在轴突退化中起到调节作用。

5.PrP106-126作用的脊髓神经元中加入Nmnatl后,可在12个小时之内有效地保护轴突免于变性,24小时之后作用明显减弱；但Nmnatl不能有效的抑制Caspase6的表达；因此,上述结果表明,Nmnatl对脊髓神经元轴突的保护作用可能与Caspase6的激活通路无关。

参考文献

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