人永生化表皮细胞的应用

背景^[1-3]

人永生化表皮细胞源自一位62岁患有黑色素瘤男性的病灶外围正常皮肤，角蛋白、角化细胞交联外膜蛋白、中间丝相关蛋白阳性。该细胞是株永生化的表皮细胞，可用于人表皮细胞角化的研究。

人永生化表皮细胞

人永生化表皮细胞培养步骤

一．人永生化表皮细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）准备人永生化表皮细胞基础培养基(GIBCO，，添加NaHCO3 1.5g/L，丙酮酸钠0.11g/L)；优质胎牛血清，10%。

2）人永生化表皮细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）人永生化表皮细胞冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二．人永生化表皮细胞处理：

1）复苏人永生化表皮细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）人永生化表皮细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）人永生化表皮细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

应用^[4][5]

人永生化表皮细胞可以用于核基质蛋白在姜黄素诱导人永生化表皮HaCaT细胞凋亡过程中的变化研究

在鉴定姜黄素(curcumin,Cur)诱导人永生化表皮HaCaT细胞凋亡的基础上,应用选择性抽提整装透射电镜和蛋白质组学分析技术,对HaCaT细胞诱导凋亡过程中核基质-中间纤维系统的构型变化和核基质蛋白组成的变化进行系统研究。分析鉴定与表皮细胞凋亡相关的特异核基质蛋白,并探索它们在表皮细胞凋亡过程中的调控作用,以期能够在较为整体的水平上进一步认识表皮细胞凋亡及其机理,从而找出表皮细胞凋亡研究的新方向。

实验结果显示,经7.5μg/mL姜黄素处理之后,人永生化表皮HaCaT细胞的增殖受到明显抑制,细胞生长抑制率达83.03%;细胞周期检测出现亚二倍体(亚G1期)细胞峰值,细胞凋亡率达13.1%,并发生G2/M期阻滞;琼脂糖凝胶电泳出现细胞凋亡典型的DNA“梯状”条带:光镜和透射电镜观察结果显示,经姜黄素诱导处理后的HaCaT细胞出现了细胞体积缩小、核质比例减小、细胞核固缩、核内染色质凝聚、线粒体肿胀、内质网网腔扩大、出现凋亡小体等显著的凋亡特征;而且与细胞凋亡相关的癌基因bcl-2表达下调,抑癌基因p53、fas、bax等表达上调。

选择性抽提整装光镜和电镜观察显示,经姜黄素处理的HaCaT细胞的核基质和中间纤维比对照组明显稀疏,且分布更加不均匀,并分别与核纤层连系,形成趋于断裂但相对还较为完整的网状结构;双向凝胶电泳分析显示在姜黄素诱导HaCaT细胞凋亡前后存在27个差异表达的核基质蛋白,经质谱分析,鉴定了其中的21个蛋白,其中在凋亡的HaCaT细胞中表达上调的9种蛋白鉴定为:Chaperonin containing TCP1、RNA binding motif、Hypothetical proteinAt4g18230、serine proteinase inhibitor、SUMO-1-specific protease、nucleoporinNUP107、coagulation factor V precursor、Apoptosis-inducing factor、Caspase 3;表达下调的6种蛋白质为LMNA protein、Vimentin、Glycosyl transferase,family 2、Actin、MAP/microtubule affinity-regulating kinase、translation initiation factor IF-2。

诱导凋亡处理后新出现的6种蛋白质为Alcohol dehydrogenase[NADP+]、锌指蛋白ZNF483、MHC classⅠantigen、M-phase phosphoprotein-1、Heat shock 90kDaprotein、Protein kinase D3。鉴定出的21种核基质蛋白中除vimentin、actin,LMNAprotein,NUP107,HSP90,SUMO-4蛋白酶,ZNF483 protein,MHC classⅠantigen,Chaperonin containing TCP1外,其余均为首次在核基质中发现的蛋白质。

研究结果表明,7.5μg/mL姜黄素对人永生化表皮HaCaT细胞的凋亡具有显著诱导作用,在HaCaT细胞凋亡过程中不仅其核基质-中间纤维系统构型产生了明显的凋亡特征性变化,而且其核基质蛋白组成也相应发生了明显改变。由此证实了与表皮细胞凋亡诱导相关特异核基质蛋白的存在及其对表皮细胞凋亡诱导的调控作用。

参考文献

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[2]Protein kinase D directly phosphorylates histone deacetylase 5 via a random sequential kinetic mechanism[J].Q.Khai Huynh;;Timothy A.McKinsey.Archives of Biochemistry and Biophysics,2006(2)

[3]Cleavage of p53-Vimentin Complex Enhances Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand-Mediated Apoptosis of Rheumatoid Arthritis Synovial Fibroblasts[J].Xinwen Yang;;Jianhua Wang;;Cunren Liu;;William E.Grizzle;;Shaohua Yu;;Shuangqin Zhang;;Stephen Barnes;;William J.Koopman;;John D.Mountz;;Robert P.Kimberly;;Huang-Ge Zhang.The American Journal of Pathology,2005(3)

[4]Induction of apoptosis in human lung cancer cells by curcumin[J].G Radhakrishna Pillai;;Anand S Srivastava;;Tarek I Hassanein;;Dharam P Chauhan;;Ewa Carrier.Cancer Letters,2004(2)

[5]杨海波.核基质蛋白在姜黄素诱导人永生化表皮HaCaT细胞凋亡过程中的变化研究[D].厦门大学,2008.