荧光素酶的使用问题

什么是荧光素酶

荧火虫荧光素酶(Firefly Luciferase)和海肾荧光素酶(Rellina Luciferase)组成双荧光素酶报告基因实验系统（Dual-Luciferase Reporter Assay）。通过加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应过程中会发出生物荧光，然后可以通过化学发光仪测定反应过程中释放的生物荧光，从而比较不同组间基因表达的差异。

下面给大家普及一下可能会遇到的问题：

1.在体外的细胞培养中，为什么要经常用抗生素筛选？

1.在体外的细胞培养中，为什么要经常用抗生素筛选？体外培养过程中，不筛选也可以，只要时间不是很长， 接种代数不要很多。到目前为止，还没有发现基因丢失的情况。但若接种的代数过多，建议用药物筛选一段时间或从原始的细胞株培养以保证细胞发光的强度，中乔新舟的LUC 、GFP 、RFP及双标记都使用puro抗性筛选。

‍2.底物荧光素(Luciferin）是如何进入小鼠体内的？需要多少？

荧光素是腹腔注射或尾部静脉注射进入小鼠体内的，约一分钟就可以扩散到小鼠全身。常用方法是腹腔注射，扩散较慢，开始发光慢，持续发光长。若进行荧光素静脉注射，扩散快，开始发光快，但发光持续时间很短。大部分发表的文章中，荧光素的浓度是150mg/kg 。20克的小鼠约需3mg的荧光素。

3.荧光素酶的发光特性如何？

通过腹腔注射老鼠后约一分钟左右荧光素酶就开始发光，通常十分钟后强度达到稳定的最高点。在最高点通常持续约20-30分钟后开始衰减，约三小时后发光全部消失。通常的检测时间是在注射后15 - 35分钟之间，但建议实验人员在做不同实验模型前进行连续时间点发光曲线的绘制，以确定最高稳值的时间范围。

4. 如何保证荧光素酶（Luciferase）的稳定性？

荧光素酶基因是插到细胞染色体上的，当细胞分裂、转移、分化时, 荧光酶也会得到持续稳定的表达。

5. 标记的肿瘤接种以后，会发生 Luciferase 的丢失吗？

丢失的可能性及量非常小，不会影响实验结果。有一些实验报道的结果中，标记的细胞在动物体内存活几年的时间还可以持续发光，说明 Luciferase 基因的标记非常稳定。

6. 可以用肿瘤块而不是细胞接种吗？

可以先用标记的细胞在皮下接种，然后从皮下取出肿瘤块进行原位接种。

7. 标记细胞与标记基因所用的启动子有何不同？

标记细胞一般用在细胞内能稳定表达的启动子, 显示细胞的数目。标记基因一般用此基因的启动子，与此基因平行表达, 显示此基因的表达数目，启动子是CMV。

8. 荧光素酶的表达高低与所用启动子的活性有关吗？

有关，启动子的活性高，则荧光素酶的表达高，启动子的活性低，则荧光素酶的表达低。

9. 常用的荧光素酶？特性如何？

荧光素酶，Luciferase 和 Renilla 荧光素酶，二者的底物不一样，前者的底物是 D-luciferin，后者的底物是 coelentarizine 。二者的发光颜色不一样，前者所发的光波长在 540-600nm，后者所发的光波长在 460-540nm 左右。前者所发的光更容易透过组织，后者在体内的代谢比前者快。大部分的发表文章通常使用前者用作报告基因， 也有一些文章使用两者进行双标记。

10.  组织切片可以观察到生物发光吗？

可以，但荧光酶的体外活性保持时间比较短， 约几十分钟。有相关的文献。