荧光素酶的应用

概述^[1]

生物发光(Bioluminescence)是在自然界广泛存在的、有生命的生物产生的一种发光现象.发光的生物种类很多，包括发光细菌、发光萤火虫、发光鱼、发光海星、发光甲虫等.而能催化荧光素或脂肪醛氧化产生生物发光的一类酶即为荧光素酶(Luciferase)。从20世纪50年代就已经开始了对荧光素酶的研究。从1986年个成功地获得表达萤火虫荧光素酶基因(luc基因)的转基因烟草以来，荧光素酶的应用和发展进入了一个崭新的时代.应用荧光素酶大大增加了生物发光免疫分析技术(BLIA)的灵敏度和应用范围，并且由于具有敏感性高，特异性好，反应迅速，操作简单，应用范围广等优点，已成为医学、生物学、环境科学等研究领域中一种新的手段。

荧光素酶的种类^[2]

自然界中具有发光能力的生物种类很多，常见的主要有：发光蘑菇(Luminousmushrooms)、发光蚯蚓(Luminousearthworms、发光细菌(Luminousbacteria)、发光水母(Luminousjellyfish)、发光甲虫(Luminousbeetles，它们主要由萤火虫(fireflies)，叩头虫(clickbeetles)和欧洲萤(glowworms)3大种类组成)。目前，除发光蘑菇和发光蚯蚓的发光机理尚不清楚外，其余生物的发光机理已研究得较为透彻，并使细菌荧光素酶(BacterialLuciferase简称BL)和萤火虫荧光素酶(FireflyLuciferase简称FL)形成商品酶用于分析检测。

北美萤火虫(Photinuspyralis，日本萤火虫(Luciolacruciata)及东欧萤火虫(L.mingrelica)可产生FL。夏威夷弧菌(Vibrioharveyi)、费氏弧菌(V.fischeri)、明亮发光杆菌(Photobacteriumphosphoreum)及鳆发光杆菌(P.leiognathi)等海洋发光细菌和发光致病杆菌(Xenorhabdusluminescens)、羽田希瓦氏菌(Alteromonashanedai)等陆生发光细菌可产生BL。

应用^[3]

1.作为报告基因检测系统

发光细菌所含的细菌荧光素酶基因(lux)表达的直接结果是产生生物发光，反应非常迅速且易于检测，因而被广泛用于基因操作，作为标记基因和报告基因来研究基因的转导、表达和调控.从20世纪80年代就开始了把荧光素酶基因当作报告基因的研究.把从哈氏弧菌中提取出来的荧光素酶基因(luxAB)插入两个质粒载体pFIT001和pPALE001中，然后结合到大豆根瘤的固氮酶的固氮基因D(nifD)和固氮基因H(nifH)的启动子上.通过宿主细胞是否发光确定转导是否成功，并通过宿主细胞的发光强度的高低来确定启动子对基因表达的影响大小。

2.用于RNA干扰研究

RNA干扰(RNAi)是一种高效的、特异的阻断体内特异基因表达的基因阻断过程，它被双链的干扰RNA所介导.这种现象可以在植物、真菌、蠕虫、甲虫和哺乳动物的细胞中观察到.在研究中发现仅仅对于一个基因而设计的少量的小干扰RNA(smallingerferingRNA，siRNA)还可以降解在哺乳动物中的同类的信使RNA (mRNA).但小干扰RNA的作用原理还未被完全了解。

3.研究蛋白质之间作用

荧光素酶还可以用于研究蛋白质磷酸化和蛋白质之间的作用.2001年根据蛋白质的剪切和诱导互补技术开发出一种新的方法.他们研究了在已知的结合位点之间的胰岛素诱导作用时，先依据蛋白质剪接原理，把DnaE内蛋白(DNA聚合酶Ⅲ的一个催化亚基)切成两个碎片，并让DnaE内蛋白的N-末端和C-末端分别与虫荧光素酶的两个碎片的N-末端和C-末端结合。然后把其中一个碎片和磷酸化的胰岛素受体底物1(IRS-1)结合，另一个碎片结合磷脂酰肌醇酯3激酶(PI3K)的SH2区域.当受到刺激后，触发了胰岛素的信号转导，IRS-1和PI3K相遇，而同样绑定在IRS-1上的虫荧光素酶碎片的N-末端和绑定在PI3K的虫荧光素酶的C-末端相遇，由于蛋白质的剪接作用发生结合，重新聚合成完整的荧光素酶，反应并发出荧光.对荧光进行监测从而对胰岛素受体后信号转导途径进行研究。

4.在细胞分析中的应用

由于在活性哺乳动物细胞中，ATP水平被严格控制，一旦细胞死亡，ATP的合成停止，从而ATP水平急剧下降.ATP已经被广泛作为一个细胞外信使.把虫荧光素酶基因插入叶酸盐受体形成一个嵌合蛋白，这个嵌合蛋白具有叶酸盐受体的N-末端的引导序列和C-末端的糖基磷脂酰肌醇着点(GPIanchor)，被称为质膜荧光素酶(pmeLUC).pmeLUC被定向的集中在质膜的外侧面，对毫摩甚至微摩浓度的ATP都很敏感，但不对其他任何核苷酸敏感.把pmeLUC传染进入P2X7受体，用荧光的变化测定P2X7受体激动剂ATP，进而对表达P2X7受体的白血病细胞系HL60，U937等进行研究.而且，还可以利用克隆的荧光素酶作为测定细胞内ATP浓度的探针，给ATP定量，进行细胞活性检测，细胞毒性筛选和细胞增殖研究.

5.微生物检测

在正常条件下，发光细菌在450～490nm时发出蓝绿色可见光.与被检物(如污水等)接触后，当被检物中具有抑制发光细菌的物质达到一定浓度时，则发光细菌的发光强度将发生改变，其变化的程度与抑制物的毒性大小有关，并与抑制物质的浓度在一定范围内相关。

6.在医学上的应用

由于荧光素酶所引导的免疫生物发光技术不仅具有灵敏度高、特异性好、应用范围广等优点，而且对荧光素酶所测定的活体没有任何毒性，这为它在医学上广泛的应用开辟了道路。

制备^[2]

作为FL生产原料的萤火虫，要依靠人工捕捉或养殖，受地域和季节性限制，且该生物生产周期长、养殖成本高、提取的酶成分复杂，随着分子生物学的发展，人们转向用基因工程的方法进行生产。1985年，deWet，J.R.等首次克隆了P.Pyralis的FL基因，并在大肠杆菌(Escherichiacoli)中表达，从中得到具有活性的FL。1986年，他们测定了FL基因的cDNA序列。随后，各种发光甲虫的FL基因相继克隆成功，并能在原核和真核表达系统中表达。

取自P.Pyralis长约1.8kb的cDNA基因在E.coli表达的产物是分子量为62kD，含550个氨基酸的多肽链，与自然提取得到的FL相比，具有同样的反应动力学特性和发射波长，在相同的反应条件下酶的稳定性亦无差异。萤火虫荧光素酶基因通过克隆在E.coli表达，转化体在37℃、LB培养基中生长到对数后期收集菌体，用渗透压法、冻融法提取细菌胞质组分，经均质、离心，用凝胶排阻、离子交换色谱提取纯酶，冷冻干燥保存。BL可从培养发光细菌直接提取得到，其制备方法与FL类似。从V.harveyi中提取的酶活可达1.8×1011LU/mg，为获得特殊用途的BL，亦可通过诱变或基因克隆得到。各种发光细菌的基因克隆均有许多报道。

主要参考资料

[1] 科学技术社会辞典·生物

[2] 荧光素酶研究进展

[3] 荧光素酶的分类、结构与应用