KASUMI-1人红白血病传代细胞系的应用
发布日期:2023/4/24 11:39:55
背景[1-3]
KASUMI-1人红白血病传代细胞系建立于一位急性白血病患者的外周血,KASUMI-1人红白血病传代细胞系髓过氧化物酶阳性,显示其髓性成熟的形态。增生试验显示,培养的KASUMI-1人红白血病传代细胞系对IL-3、IL-6、G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、GM-CS(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)有响应,但对IL-1和IL-5没有响应。在体外液体培养中分别加入二甲亚砜、G-CSF、IL-5,也没有观察到粒性或嗜酸性细胞的成熟。KASUMI-1人红白血病传代细胞系培养过程中,加入佛波酯可以看到诱导出的巨噬细胞样细胞。
KASUMI-1人红白血病传代细胞系
KASUMI-1人红白血病传代细胞系具有人急性淋巴白血病细胞的典型特征,是研究人急性淋巴白血病的极佳材料。KASUMI-1人红白血病传代细胞系是一个带有8:21号染色体转位的白血病细胞株,这个转位使得AML1基因和ETO(或称MTG8)基因串联,使融合基因AML1-ETO(也称作AML1-MTG或RUNX1-CBF2T1)的表达升高,因而细胞产生嵌合的AML1-ETO蛋白。这个蛋白下调CEBPA mRNA、蛋白和DNA的结合活性,而这种结合对粒性白细胞的分化是极端重要的。
KASUMI-1人红白血病传代细胞系培养步骤:
一.KASUMI-1人红白血病传代细胞系培养基及培养冻存条件准备:
1)准备1640培养基;优质胎牛血清,20%;Gluta-max(invitrogen 35050)1%;双抗,1%。
2)注意事项:
a)该细胞复苏后成活率较低,会出现大量死细胞和死细胞碎片,培养两周后有所好转。建议每1-2周对细胞进行1000rpm,5mins离心,弃掉上清,加入新鲜完全培养液,可以去掉部分细胞碎片和颗粒。培养过程中会出现死细胞和细胞碎片,收到邮寄的活细胞的用户若发现培养物内有部分死细胞和细胞碎片,此为正常现象。
b)细胞培养过程中会有轻微聚团,轻轻吹打开即可。当细胞密度较大或者培养液变黄时,需要及时进行半换液或者完全换液。
c)该细胞对血清质量较为敏感,我库建议您使用进口大品牌优质血清进行培养。
d)请注意保持细胞密度在合适的范围(3x105~3x106/ml),不能过稀。
3)KASUMI-1人红白血病传代细胞系培养条件:气相:空气,95%;二氧化碳,5%。温度:37摄氏度,培养箱湿度为70%-80%。
4)KASUMI-1人红白血病传代细胞系冻存液:90%血清,10%DMSO,现用现配。
二.KASUMI-1人红白血病传代细胞系细胞处理:
1)复苏KASUMI-1人红白血病传代细胞系细胞:将含有1mLKASUMI-1人红白血病传代细胞系细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入250px皿中,加入约8ml培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。
2)KASUMI-1人红白血病传代细胞系细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
对于KASUMI-1人红白血病传代细胞系贴壁细胞,传代可参考以下方法:
1.弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3)KASUMI-1人红白血病传代细胞系细胞冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。下面T25瓶为例;
1.KASUMI-1人红白血病传代细胞系细胞冻存时,弃去培养基后,PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶,细胞变圆脱落后,加入2ml完全培养基终止消化,可使用血球计数板计数。
2.1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮,加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀,按每1ml的数量分配到冻存管中,注意冻存管做好标识。明舟生物(mingzhoubio)按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。
3.将冻存管置于程序降温盒中,放入-80度冰箱,至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
KASUMI-1人红白血病传代细胞系可以用于地西他滨诱导Kasumi-1白血病细胞G2/M期阻滞和凋亡的作用机制研究
为了明确原发性AML中甲基转移酶的表达和DNA甲基化情况,本研究首先利用TCGA癌症基因组图谱数据库及DNA甲基化修饰情况进行分析,结果发现DNMT3a在人AML中表达上调,DNA甲基化修饰增多。接下来,添加DAC培养原发性AML细胞系Kasumi-1,并检测其生物学行为,结果显示,DAC抑制Kasumi-1细胞增殖、影响细胞周期阻滞于G2/M期,促进细胞凋亡。
为了进一步验证DAC对细胞周期的调控作用,用RT-q PCR方法检测调控细胞周期调控因子的表达,结果发现p21、p53、CDC25A、CDC2、CCNB1、WEE1的表达均上调,表明G2/M期阻滞可能通过p21/cdc25C/cdc2/cyclin B基因表达的改变而抑制Kasumi-1细胞的增殖。
为了研究DAC处理导致Kasumi-1细胞周期阻滞G2/M期的机制,首先,利用TCGA数据库通过UALCAN系统在线分析,发现在AML患者细胞中和DNMT3a存在负调控关系的基因共541个,其中钙结合蛋白S100A11与DNMT3a存在显著的负调控关系,其在AML中低表达但不显著。
进一步对DAC处理的Kasumi-1细胞进行转录组测序,并将转录组测序中表达上调的基因和TCGA、GEO数据库中的AML较正常骨髓DNA甲基化程度显著降低的基因群,进行交叉分析,发现204个基因在AML骨髓和Kasumi-1细胞中均发生显著变化,其中包含丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶ATM。
进一步验证发现,DAC处理后ATM和P53的表达显著上调,显示DAC可能通过改变p53和ATM的表达而促进Kasumi-1细胞G2/M期阻滞和凋亡的作用。
参考文献
[1]Synergistic inhibitory effects of low?dose decitabine in combination with bortezomib in the AML cell line Kasumi?1[J].Mpakou Vassiliki;Spathis Aris;Bouhla Anthi;Mpazani Efthimia;Papageorgiou Sotirios;Gkontopoulos Konstantinos;Glezou Eirini;Thomopoulos Thomas;Foukas Periklis;Pappa Vasiliki.Experimental and Therapeutic Medicine,2021(3)
[2]Epigenetic modifications of histones in cancer.[J].Zhao Zibo;;Shilatifard Ali.Genome biology,2019(1)
[3]Association between increased mutation rates in DNMT3A and FLT3-ITD and poor prognosis of patients with acute myeloid leukemia.[J].Zhang Qiurong;;Wu Xiao;;Cao Jing;;Gao Feng;;Huang Kun.Experimental and therapeutic medicine,2019(4)
[4]Aberrant DNA Methylation in Acute Myeloid Leukemia and Its Clinical Implications[J].Xianwen Yang;;Molly Pui Man Wong;;Ray Kit Ng.International Journal of Molecular Sciences,2019(18)
[5]单丽冬.地西他滨诱导Kasumi-1白血病细胞G2/M期阻滞和凋亡的作用机制研究[D].内蒙古大学,2021.
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