金松双黄酮的制备方法

背景及概述^[1][2]

金松双黄酮 (sciadopitysin， SP) 属双黄酮类化合物，主要分布于裸子植物中， 如香附 (Rhizoma Cyperi)、银杏 (Ginkgo biloba)、柳杉(Japan cedar)、罗汉松 (Podocarpus macrophyllus)、红豆杉 (Taxus chinensis) 等，是目前被国内外大量研究的银杏提取物及银杏制品中的活性成分。金松双黄酮( sciadopitysin) 是银杏叶中的特有成分之一，具有良好的抗炎、抑制肿瘤细胞、清除自由基等作用。银杏(Ginkgo biloba L) 为银杏科银杏属植物，系我国特有树种，又名白果，是最古老的中生代孑遗稀有植物之一，有裸子植物“活化石”之称。《本草纲目》 记载:银杏性平味甘苦涩，有小毒入肺，有益肺气、定痰喘、止带浊、缩小便、通经、杀虫等功效。

制备^[1]

1 药材的提取

取干燥银杏叶2.0kg，粉碎，以95%乙醇超声提取3次，提取液合并，减压浓缩至无醇味，即得银杏叶提取液。

2 化合物的分离

将银杏叶提取液用石油醚超声脱脂，再用乙酸乙酯萃取，过滤，将滤液减压浓缩，得提取物。提取物经硅胶(200～300 目)柱层析分离，以石油醚-乙酸乙酯(9∶1～5∶5)梯度洗脱，根据薄层色谱结果，合并相同斑点，得金松双黄酮部分， 经二甲基甲酰氨重结晶，得黄色针晶 98mg。

3 对照品的结构鉴定

黄色针晶，mp > 300 ℃，易溶于吡啶、DMF 和 NaOH 水溶液。硫酸显黄色，FeCl₃显绿色，盐酸-镁粉反应呈橙色。UVλMax nm:208，272，328；EI-MSm/z(% )580［M］⁺ ，579［M-H］⁺ ，565［M-CH₃］⁺ ，549［M-OCH\-3］⁺ ，534［M-OCH₃-CH₃］⁺；¹H-NMR(500Hz，DMSO-d6 )δ:6. 89( H-3)、6. 42(H- 6)、7. 61(H- 2′)、7. 59( H- 6′)、6. 92( H- 3′)、6. 99(H- 5′)、 6. 94 ( H- 3″)、 6. 37 ( H- 6″)、6. 78 ( H- 8″)、8. 08 ( H-2″′)、7. 36(H- 5″′)、 3. 29( H- 4″′-OCH3 )、3. 76( H- 4″- OCH3 )、3. 83(H- 7″- OCH3 )、10. 80( H- 7″-OH)；¹³ C-NMR (125 MHz，DMSO-d6 ) δ:16. 1(C- 2)、 103. 2 ( C- 3)、181. 9 ( C- 4)、 103. 6(C- 4a)、 160. 6 (C - 5)、98. 6 (C - 6)、161. 9 (C- 7)、103. 6 (C-8)、154. 3 ( C- 8a)、122. 7 ( C- 1′)、127. 7 ( C- 2′)、114. 5 ( C-3′)、162. 2 ( C- 4′)、114. 5 ( C- 5′)、128. 8 ( C- 6′)、163. 5 ( C-2″)、103. 8 (C- 3″)、 181. 9 ( C- 4″)、104. 7 ( C- 4a″)、161. 1 ( C-5″)、98. 4 ( C- 6″)、165. 1 ( C- 7″)、 92. 7 ( C- 8″)、157. 3 ( C-8a″)、122. 6 ( C- 1″′)、130. 8 ( C- 2″′)、121. 6 ( C- 3″′)、 160. 5(C- 4″′)、111. 7 (C- 5″′)、 128. 3 ( C- 6″′)、55. 4 ( C- 4′-OCH3 )、55. 9 (C- 4′″-OCH3 )、 55. 8 ( C- 7′″-OCH3 )。波谱数据与文献报道金松双黄酮基本一致，确定其结构为金松双黄酮。

4 定性鉴定和定量检测

4. 1 薄层色谱法定性鉴别

将制备所得金松双黄酮样品薄层点样，分别以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(50 ∶ 40∶10)、苯-丁酮-甲酸(60∶20∶20)、 甲苯-甲酸乙酯-甲酸(50∶40∶10) 为展开剂，进行薄层分析，以5% AlCl3 显色后置紫外灯 254 nm下观察，均为亮黄色均一斑点，无其它杂质斑点。

4. 2 HPLC 定量分析

色谱柱:Agilent zorbax SB-C18 ( 250mm×4. 6 mm，5μm)；流动相:甲醇-水(80∶20)、乙腈-水(70∶30)；流速1. 0 mL /min，检测波长272 nm；柱温40 ℃；进样量20μl，检测器灵敏度 0. 04 AUFS。经检测在不同色谱条件下，所制备金松双黄酮样品为单一主峰，改变流动相分析，未见异常峰，以面积归一化法计算，所制金松双黄酮纯度为 98. 5%，见图 1。

药理研究^[2]

王欣欣等人证实了金松双黄酮对UGT1A1、UGT1A3、UGT1A8 和 UGT1A10催化的葡糖醛酸化反应表现出较强的竞争性抑制作用，对于UGT1A10，其0.1<[I]/Ki <1，提示有可能发生 DDI。对于 UGT1A1、UGT1A3和UGT1A8，其 [I] / Ki > 1，提示有可能发生非常严重的 DDI。UGT1A1 是肝脏中胆红素代谢的关键酶，金松双黄酮对 UGT1A1的强烈抑制作用会减少胆红素的葡糖醛酸结合，致使游离的胆红素浓度升高，导致黄疸等胆红素相关病症的发生。因此出于安全性考率，含有高剂量金松双黄酮的中草药制品尽量避免与经过UGT1A1 代谢的药物共服，尤其针对那些肝损伤及高胆红素血症的患者。UGT1A1 还介导了很多药物的代谢， 如抗肿瘤药物依托泊苷、降脂药物依泽替米贝、以及结肠癌治疗药物伊立替康的活性代谢产物SN-38，这些药物与包含金松双黄酮的中草药或相关制品联用时，很可能发生 DDI 从而导致药物疗效的改变。此外，在使用预测结果解释金松双黄酮与一些药物的相互作用时，还应考虑到 UGT1A1 基因多态性的影响，UGT1A1 基因突变导致酶表达水平的不同也会影响预测结果的准确性，例如，UGT1A1*28 号基因突变的 Gilbert 综合征患者体内 UGT1A1 的表达均低于正常人，这类患者对于经 UGT1A1 介导的药物的代谢消除以及对胆红素的结合能力也会降低，更容易受到该抑制作用的影响。对于这种情况应该避免与金松双黄酮的联合用药。UGT1A3 不仅介导内源性物质胆汁酸 (bile acids)的代谢消除，而且参与了许多芳烃、碳氢化合物、胺、非甾体类抗炎药 (NSAIDs)、以及他汀类药物的代谢消除。

UGT1A8 和 UGT1A10 是重要的肠道代谢酶，能够催化诱导曲格列酮和雷洛昔芬等药物以葡糖醛酸化代谢产物的形式排出体外，这些物质同含有金松双黄酮的中草药或相关制品的联合用药可能会影响其葡糖醛酸化结合反应的速率，使血药浓度异常升高，引起毒性反应产生不可预知的临床后果。尤其是对于治疗窗窄及浓度−效应变化剧烈的药物，代谢酶的抑制作用更容易使肝脏代谢清除率降低而导致药物蓄积。OTS167 是一种处于临床试验阶段的抗肿瘤剂，能够有效的抑制胚胎亮氨酸拉链激酶，有研究表明 OTS167 主要经过 UGT1A1、UGT1A3、UGT1A8和 UGT1A10 代谢，临床上该药与金松双黄酮的合用应给予密切关注。然而代谢酶抑制介导的 DDI 不仅可能引发毒性反应，还可能产生某些积极的作用，通过改善一些口服生物利用度低或首过消除严重的药物的代谢吸收，减缓肠道代谢药物的葡糖醛酸化反应，提高药物的生物利用度。此外对于那些经过UGT1A1、UGT1A3、UGT1A8 和 UGT1A10 代谢且具有较高治疗指数的药物，同含金松双黄酮的中药或制品联合用药可延长药物在体内的消除半衰期，提高疗效。综上所述，上述结果对含金松双黄酮的中草药及相关制剂的临床合理用药，避免基于 UGT 抑制导致的不良 DDI， 具有重要参考价值。

主要参考资料

[1]孔繁晟，严春艳，庞小雄，贲永光.从银杏叶中制备金松双黄酮对照品的研究[J].中成药，2010，32(05):878-879.

[2]王欣欣，侯洁，宁静，潘永强，洪沫，郭斌.金松双黄酮对尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶的抑制作用[J].药学学报，2016，51(05):749-755.