人腺苷酸环化酶1(AC-1)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人腺苷酸环化酶1(AC-1)ELISA KIT用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人腺苷酸环化酶1(AC-1)的含量。

实验原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被腺苷酸环化酶1(AC-1)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的腺苷酸环化酶1(AC-1)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人腺苷酸环化酶1(AC-1)ELISA KIT

样本处理及要求

1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

应用^[4][5]

用于稻曲病菌腺苷酸环化酶UvAc1和磷酸二酯酶UvPdeH的功能研究

对稻曲病菌中的腺苷酸环化酶UvAc1和磷酸二酯酶UvPdeH的生物学功能进行了研究。研究结果对了解该病菌的致病分子机制具有重要的理论意义,同时可为新型药剂的开发提供潜在靶标。主要研究结果如下:环腺苷单磷酸（cAMP）信号通路在调控真核生物的生长发育和致病过程中具有重要作用,cAMP作为第二信使可激活下游信号通路。细胞内cAMP水平主要由腺苷酸环化酶（ACs）合成和磷酸二酯酶（PDEs）水解进行生物催化调节。

在本论文中,鉴定了水稻稻曲病菌的腺苷酸环化酶（UvAc1）和对cAMP具有高亲和力的磷酸二酯酶（UvPdeH）,这两个蛋白分别是水稻稻瘟病菌中MoMac1和MoPdeH的同源蛋白。异源回补实验显示,UvAc1和UvPdeH均可部分或完全回补稻瘟病菌ΔMomac1和ΔMopdeH突变体的生长、产孢、附着胞形成和致病力等表型缺陷。

进一步采用CRISPR/Cas9和同源重组技术获得了UvAc1和UvPdeH在稻曲病菌中的敲除突变体,并对突变体进行了一系列的表型分析。

结果显示,ΔUvac1和ΔUvpdeH突变体在稻曲病菌分生孢子的产生、孢子形态和孢子萌发中均出现缺陷;突变体致病能力显著降低,其培养滤液毒性降低。胁迫实验显示,ΔUvac1对荧光增白剂（CFW）、氯化钠（NaCl）和山梨糖醇（Sorbitol）表现为更加敏感,对刚果红（CR）敏感性降低,而ΔUvpdeH对十二烷基硫酸钠（SDS）,刚果红,山梨糖醇及过氧化氢（H2O2）的敏感性增加,对CFW和NaCl敏感性降低。

高效液相色谱法（HPLC）测定结果显示,ΔUvpdeH突变体胞内cAMP水平显著上升,ΔUvac1突变体显著下降。此外,外源添加磷酸二酯酶抑制剂IBMX处理的野生型菌株表现出与ΔUvpdeH突变体相似的表型。综上所述,我们的研究结果表明UvAc1和UvPdeH是cAMP信号通路的保守组分,对稻曲病菌的营养生长、无性繁殖、胁迫应答、致病力和胞内cAMP水平均具有重要的调控作用。

参考文献

[1]Towards understanding the biosynthetic pathway for ustilaginoidin mycotoxins in Ustilaginoidea virens.[J].Li Yuejiao,Wang Ming,Liu Zhaohui,Zhang Kang,Cui Fuhao,Sun Wenxian.Environmental microbiology.2019(8)

[2]MoMip11,a MoRgs7-interacting protein,functions as a scaffolding protein to regulate cAMP signaling and pathogenicity in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.[J].Yin Ziyi,Zhang Xiaofang,Wang Jingzhen,Yang Lina,Feng Wanzhen,Chen Chen,Gao Chuyun,Zhang Haifeng,Zheng Xiaobo,Wang Ping,Zhang Zhengguang.Environmental microbiology.2018(9)

[3]CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering[J].Gavin J.Knott,Jennifer A.Doudna.Science.2018(6405)

[4]New findings on phosphodiesterases,MoPdeH and MoPdeL,in Magnaporthe oryzae revealed by structural analysis.[J].Yang Li-Na,Yin Ziyi,Zhang Xi,Feng Wanzhen,Xiao Yuhan,Zhang Haifeng,Zheng Xiaobo,Zhang Zhengguang.Molecular plant pathology.2018(5)

[5]郭维文.稻曲病菌腺苷酸环化酶UvAc1和磷酸二酯酶UvPdeH的功能研究[D].南京农业大学,2019.