猪表皮生长因子(EGF)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

猪表皮生长因子(EGF)ELISA KIT用于体外定量检测血清、血浆或其它相关生物液体中表皮生长因子(EGF)的含量。

检测原理:本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗表皮生长因子(EGF)抗体包被于酶标板上，实验时样品（或标准品）中的表皮生长因子(EGF)会与包被抗体结合，游离的成分被洗去，然后依次加入生物素化的抗表皮生长因子(EGF)抗体，HRP-链霉亲和素结合物,最后加入单组份TMB底物液。TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，表皮生长因子(EGF)浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中表皮生长因子(EGF)的浓度。

猪表皮生长因子(EGF)ELISA KIT

样品收集:

1.血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。

2.血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na2，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

操作步骤：

1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。

4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5．每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。

8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9．在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于人表皮生长因子在毕赤酵母中分泌表达的研究

通过优化信号肽序列及基因剂量,共表达分子伴侣PDI与转录因子Aft1、Hac1p,以期提高人表皮生长因子在毕赤酵母中的分泌表达水平,得到高效表达人表皮生长因子的毕赤酵母基因工程菌株。

（1）根据巴斯德毕赤酵母密码子偏好性,优化信号肽并将优化的序列Nα插入p PICZαA中,获得重组载体p PICZ-Nα。以p PICZ-Nα和p PICZα-rhEGF为模板,获得片段Nα和rhEGF。通过SOE-PCR构建重组片段Nα-rhEGF,并插入p PICZαA中获得p PICZ-Nα-rhEGF。将重组载体转移至巴斯德毕赤酵母KM71基因组中,得到表达菌株KM71-p PICZ-α-rhEGF和KM71-p PICZ-Nα-rhEGF。菌株KM71-p PICZ-α-rhEGF、KM71-p PICZ-Nα-rhEGF经摇瓶诱导发酵96h,取上清进行检测,结果表明KM71-p PICZ-α-rhEGF胞外分泌总蛋白、活性分别达到93.2675±13.4678 mg/L、96065±5609 IU/m L,KM71-p PICZ-Nα-rh EG F胞外分泌总蛋白、活性分别达到134.5165±17.7482 mg/L、141242±18128 IU/m L,相比菌株KM71-p PICZ-α-rhEGF分别提高了44.22%和47.02%。

（2）利用内切酶BglⅡ和Bam HⅠ互为同尾酶,以p PICZ-Nα-rhEGF为基础,分别构建含2、3、4、5拷贝数人表皮生长因子表达框的重组质粒p PICZ-2Nα-rhEGF、p PICZ-3Nα-rhEGF、p PICZ-4Nα-rhEGF、p PICZ-5Nα-rhEGF,并连接His4片段。将线性化后的重组质粒p PICZ-2Nα-rhEGF-His4、p PICZ-3Nα-rhEGF-His4、p PICZ-3Nα-rhEGF-His4和p PICZ-5Nα-rhEGF-His4电转化至毕赤酵母KM71菌株,在含Zeocin抗生素（100μg/m L）的YPDS平板进行筛选,重组子用荧光定量PCR进行鉴定,得到分别含2、3、4、5拷贝人表皮生长因子表达框的毕赤酵母重组菌株表达菌株KM71-p PICZ-2Nα-rhEGF-His4、K M71-p PICZ-3Nα-rhEGF-His4、KM71-p PICZ-4Nα-rhEGF-His4、KM71-p PICZ-5Nα-rhEGF-His4。将含1、2、3、4、5拷贝人表皮生长因子表达框的重组菌株经摇瓶诱导发酵96 h,取发酵上清液进行检测。菌株KM71-p PICZ-Nα-rhEGF、KM71-p PIC Z-2Nα-rhEGF-His4、KM71-p PICZ-3Nα-rhEGF-His4、KM71-p PICZ-4Nα-rhEGF-His4、KM71-p PICZ-5Nα-rhEGF-His4胞外分泌总蛋白产量分别为134.5165±17.7482 mg/L;143.9850±17.862 mg/L、169.6153±17.6628 mg/L、237.6390±23.6773 mg/L、127.3843±15.6234 mg/L,发酵液上清总活性分别为137040±25124IU/m L、153344±23105 IU/m L、175551±19862 IU/m L、235052±23398 IU/m L和1118467±24170 IU/m L。四拷贝菌株KM71-p PICZ-4Nα-rhEGF-His4胞外蛋白总量与活性最高,较一拷贝表达菌株KM71-p PICZ-Nα-rhEGF,其胞外蛋白含量和最终胞外蛋白含量分别提高了81.73%和71.52%。菌株KM71-p PICZ-5Nα-rhEGF-His4分别仅为四拷贝菌株的53.60%和50.40%。

（3）提取菌株DH5α-p PICZ9K-PDI-G418、DH5α-p PICZ9K-Aft1-G418和DH5α-p PICZ9K-Hac1p-G418质粒后使用电转法,得到共表达菌株KM71-p PIC Z-4Nα-rhEGF-His4-PDI、KM71-p PICZ-4Nα-rhEGF-His4-Aft1和KM71-p PICZ-4Nα-rhEGF-His4-Hac1p。共表达菌株KM71-p PICZ-4Nα-rhEGF-His4-PDI、KM71-p PICZ-4Nα-rh EG F-His4-Aft1、KM71-p PICZ-4Nα-rhEGF-His4-Hac1p经小批量发酵96h后检测发酵液中胞外分泌总蛋白含量分别为227.4239±20.1687 mg/L、144.5416±20.0676 mg/L、171.006±24.3572 mg/L、309.0315±25.4678 mg/L;总活性分别为218554±27542 IU/m L、145987±24268 IU/m L、176136±25087 IU/m L、311812±22697 IU/m L。其中,共表达分子伴侣PDI与转录因子Aft1对分泌目标蛋白产生负面影响,共表达转录因子Hac1p对菌株分泌目标蛋白具有显著促进作用,相较于四拷贝菌株KM71-p PICZ-4Nα-rhEGF-His4胞外蛋白含量和活性分别提升了35.88%和36.68%。

参考文献

[1]Heterologous Protein Expression in Pichia pastoris:Latest Research Progress and Applications.[J].Juturu Veeresh,Wu Jin Chuan.Chembiochem:a European journal of chemical biology.2018(1)

[2]Effect of cooperation of chaperones and gene dosage on the expression of porcine PGLYRP-1 in Pichia pastoris.[J].Yang Jun,Lu Zhipeng,Chen Jiawei,Chu Pinpin,Cheng Qingmei,Liu Jie,Ming Feiping,Huang Chaoyuan,Xiao Anji,Cai Haiming,Zhang Linghua.Applied microbiology and biotechnology.2016(12)

[3]Pichia pastoris Aft1--a novel transcription factor,enhancing recombinant protein secretion.[J].Ruth Claudia,Buchetics Markus,Vidimce Viktorija,Kotz Daniela,Naschberger Stefan,Mattanovich Diethard,Pichler Harald,Gasser Brigitte.Microbial cell factories.2014(1)

[4]Protein expression in Pichia pastoris:recent achievements and perspectives for heterologous protein production.[J].Ahmad Mudassar,Hirz Melanie,Pichler Harald,Schwab Helmut.Applied microbiology and biotechnology.2014(12)

[5]王儒昕.人表皮生长因子在毕赤酵母中分泌表达的研究[D].武汉轻工大学,2020.