小鼠Β内酰胺酶抑制剂(BLI)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

小鼠Β内酰胺酶抑制剂(BLI)ELISA KIT用于体外定量检测血清、血浆或其它相关生物液体中Β内酰胺酶抑制剂(BLI)的含量。

检测原理:本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗Β内酰胺酶抑制剂(BLI)抗体包被于酶标板上，实验时样品（或标准品）中的Β内酰胺酶抑制剂(BLI)会与包被抗体结合，游离的成分被洗去，然后依次加入生物素化的抗Β内酰胺酶抑制剂(BLI)抗体，HRP-链霉亲和素结合物,最后加入单组份TMB底物液。TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，Β内酰胺酶抑制剂(BLI)浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中Β内酰胺酶抑制剂(BLI)的浓度。

小鼠Β内酰胺酶抑制剂(BLI)ELISA KIT

样品收集:

1.血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。

2.血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na2，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

操作步骤：

1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。

4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5．每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。

8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9．在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于利用酵母双杂交系统筛选β-内酰胺酶抑制剂研究

通过酵母双杂交系统从随机核苷酸库中筛选到抑制β-内酰胺酶的短肽。在设计一段随机寡核苷酸时,将BLIP与β-内酰胺酶结合中的一些关键信息考虑进去,一方面可以扩展β-内酰胺酶抑制肽的范围,另一方面可以增加筛选成功的可能性。在筛选新β-内酰胺酶抑制剂的研究工作中,需要纯度较高的β-内酰胺酶来验证筛选得到的短肽是否具有抑制作用。

因此,首先将β-内酰胺酶基因克隆至pLY-5载体中,构建表达质粒pYG201。在pYG201质粒中β-内酰胺酶基因处于λ噬菌体PL启动子控制下,通过42℃热激解除阻遏物（cIts857）的阻遏,高效表达β-内酰胺酶。

外源蛋白高效表达易形成包含体,通过对包含体的溶解、复性和纯化过程的研究,最终获得有活性的β-内酰胺酶并达到90%以上的纯度。

通过PCR方法将随机的单链寡核苷酸大量扩增为双链,再经过一系列基因操作将扩增后的随机双链基因与pGAD424质粒载体中的激活域融合,构建随机核苷酸文库,即猎物质粒文库。通过对酵母转化条件的研究确定了转化的条件,其条件是:选择PEG4000为促进剂和42℃热激时间为30min,获得的转化率为1.4×10~5cfu/μg DNA。随机核苷酸文库的构建和酵母转化条件的研究为后续的酵母双杂交筛选奠定了基础。

将pYG111和pYG202（随机核苷酸文库）共同转化酵母Y153,通过初筛和复筛最终得到的三株阳性转化子,分离得到的质粒分别命名为pYG202-p1、pYG202-p2、和pYG202-p3。β-半乳糖苷酶的定量测定表明P3与β-内酰胺酶在酵母体内的相互作用最强,测得的米勒单位为10.2;P1次之,米勒单位为4.3:P2的米勒单位为2.1。用VectorNTI软件分析所测定的序列表明:通过酵母双杂交系统筛选得到的三株阳性克隆中,其随机序列之间的差异较大。

但这三个肽在酵母体内均能与β-内酰胺酶发生相互作用,这1几海医药一l几业研究院博l:学位论文摘要可能与核心氨基酸序列（AAGDYY）的存在有很大关系。

通过酵母双杂交系统从一个随机DNA文库中筛选到三个编码能与p一内酞胺酶结合的短肤（Pl、PZ、和P3）的DNA序列,在本研究中将编码P1和P3的基因分别克隆到pGEX一4T-1的多克隆位点中,得到重组质粒pYG205一Pl和一p3。

加入适量的IPTG诱导外源基因在宿主中表达GST-短肤融合蛋白,运用sePharose 4B亲和层析介质分离纯化GST-短肤,然后用凝血酶（thrombin）将短肤从融合蛋白中切下。体外测定Pl和P3与p一内酞胺酶的结合作用,结果表明P3可以抑制酶的活性,而Pl不能抑制酶的活性。

参考文献

[1]Protein folding in vivo and renaturation of recombinant proteins from inclusion bodies[J].Andrew D.Guise,Shuna M.West,Julian B.Chaudhuri.Molecular Biotechnology.1996(1)

[2]Multiple peptide synthesis[J].John E.Fox.Molecular Biotechnology.1995(3)

[3]Genetics of extended-spectrum beta-lactamases[J].G.A.Jacoby.European Journal of Clinical Microbiology＆Infectious Diseases.1994(1)

[4]High efficiency transformation of intact yeast cells using single stranded nucleic acids as a carrier[J].Robert H.Schiestl,R.Daniel Gietz.Current Genetics.1989(5)

[5]孙伟.利用酵母双杂交系统筛选β-内酰胺酶抑制剂[D].上海医药工业研究院,2004.