鸡弓形虫循环抗原(TCA)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

鸡弓形虫循环抗原(TCA)ELISA KIT用于体外定量检测血清、血浆或其它相关生物液体中鸡弓形虫循环抗原(TCA)的含量。

检测原理:本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗鸡弓形虫循环抗原(TCA)抗体包被于酶标板上，实验时样品（或标准品）中的鸡弓形虫循环抗原(TCA)会与包被抗体结合，游离的成分被洗去，然后依次加入生物素化的抗Β内酰胺酶抑制剂(BLI)抗体，HRP-链霉亲和素结合物,最后加入单组份TMB底物液。TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，鸡弓形虫循环抗原(TCA)浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中鸡弓形虫循环抗原(TCA)的浓度。

鸡弓形虫循环抗原(TCA)ELISA KIT

样品收集:

1.血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。

2.血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na2，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

操作步骤：

1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。

4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5．每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。

8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9．在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于鸡源弓形虫治疗药物的筛选及弓形虫排泄分泌抗原巨噬细胞结合分子的鉴定和功能研究

鸡源弓形虫治疗药物的筛选为了筛选能有效治疗鸡弓形虫病的药物,本研究首先利用ICR品系小鼠模型进行药物初筛,在此基础上,挑选抗小鼠弓形虫感染效果、中等、较差的三种药物或药物配伍治疗鸡弓形虫感染并做出合理评价。用刚地弓形虫RH和JS株速殖子,按1×104/鼠和1×108/鸡分别腹腔接种小鼠和鸡,接种后4 h用药组通过灌服或饮水给药,连续用药5d,接种后20d或10d结束实验,根据存活率、平均存活时间等指标得出疗效。结果发现,在抗小鼠弓形虫感染试验中,磺胺氯吡嗪钠+甲氧苄啶组治疗效果,阿奇霉素次之,其余药物抗弓形虫作用不明显。在抗鸡弓形虫感染试验中,阿奇霉素和磺胺氯吡嗪钠+甲氧苄啶组均能显著提高雏鸡的存活率,前者（44.4%）略高于磺胺氯吡嗪钠+甲氧苄啶组（33.3%）,但两者无明显差异（P＞0.05）。

研究结果表明,阿奇霉素和磺胺氯吡嗪钠联合甲氧苄啶对鸡弓形虫感染有明显治疗效果。弓形虫排泄分泌抗原（excretory/secretory antigens,ESA）在弓形虫入侵宿主的早期就开始分泌,在入侵过程中发挥重要作用。由于排泄分泌抗原具有很好的免疫原性,现已广泛用于弓形虫病的诊断。免疫排泄分泌抗原可诱导机体产生强烈的体液、细胞免疫应答反应,可用于弓形虫病的免疫预防。此外,ESA还具有抗肿瘤等重要作用。到目前为止,有关弓形虫排泄分泌抗原对宿主细胞的调节作用的研究还相对较少,对巨噬细胞的调节作用研究几乎没有;同时分析和鉴定结合宿主细胞的排泄分泌抗原,对于进一步理解排泄分泌抗原的功能以及其如何发挥作用的机制是至关重要的。

因此,进行了以下研究:弓形虫排泄分泌抗原对小鼠巨噬细胞免疫功能调节研究本部分研究旨在观察弓形虫排泄分泌抗原对小鼠单核巨噬细胞Ana-1免疫功能的影响。用不同浓度的弓形虫排泄分泌抗原分别与小鼠巨噬细胞Ana-1共培养,观察不同处理对Ana-1细胞增殖和吞噬的影响,用ELISA检测不同处理后的Ana-1细胞上清中IL-1β、IL-10、TNF-α和TGF-β1的表达,并用流式细胞术检测作用后的Ana-1细胞表面Toll样受体分子表达水平的变化以及是否促进细胞的凋亡。结果显示,弓形虫排泄分泌抗原能够显著抑制小鼠巨噬细胞的增殖和吞噬功能,并显著诱导细胞产生凋亡。ESA作用Ana-1巨噬细胞后,下调了细胞因子TNF-α和IL-1β的分泌,同时上调了细胞因子TGF-β1和IL-10的分泌。ESA作用Ana-1巨噬细胞后,Ana-1细胞表面的Toll样受体2和4的活化受到抑制,NO的分泌也受到抑制。此外,弓形虫ESA可以抑制LPS诱导的Ana-1巨噬细胞中NF-κB的激活。结果表明,弓形虫ESA在体外可显著调节Ana-1细胞的免疫功能。

参考文献

[1]Fucoidan exerts protective effects against diabetic nephropathy relatedto spontaneous diabetes through the NF-κB signaling pathway in vivo and in vitro[J].Yan Wang,Minghao Nie,Yanhong Lu,Rui Wang,Jin Li,Bin Yang,Mingyang Xia,Haiyang Zhang,Xiurong Li.International Journal of Molecular Medicine.2015(4)

[2]Secreted Toxoplasma gondii molecules interfere with expression of MHC-II in interferon gamma-activated macrophages[J].Louis-Philippe Leroux,Dayal Dasanayake,Leah M.Rommereim,Barbara A.Fox,David J.Bzik,Armando Jardim,Florence S.Dzierszinski.International Journal for Parasitology.2015(5)

[3]Genetic characterization of Toxoplasma gondii isolates from Portugal,Austria and Israel reveals higher genetic variability within the type II lineage[J].S.K.VERMA,D.AJZENBERG,A.RIVERA-SANCHEZ,C.SU,J.P.DUBEY.Parasitology.2015(7)

[4]Excretory–secretory antigens:A suitable candidate for immunization against ocular toxoplasmosis in a murine model[J].Kiumars Norouzpour Deilami,Ahmad Daryani,Ehsan Ahmadpour,Mehdi Sharif,Yousef Dadimoghaddam,Shahabeddin Sarvi,Ahad Alizadeh.Comparative Immunology,Microbiology and Infectious Diseases.2014(5-6)

[5]王帅.鸡源弓形虫治疗药物的筛选及弓形虫排泄分泌抗原巨噬细胞结合分子的鉴定和功能研究[D].南京农业大学,2015.