人结肠癌抗原(CCA)Elisa试剂盒的应用

背景^[1-3]

人结肠癌抗原(CCA)Elisa试剂盒是一种通过酶联免疫技术（Elisa）原理特异性识别样本中人结肠癌抗原(CCA）的商品化试剂盒。人结肠癌抗原(CCA)Elisa试剂盒可以通过识别样本中人结肠癌抗原(CCA)的类别及含量为科研及临床诊断提供依据。

需要注意的是若用于临床诊断的Elisa试剂盒需取得上市所在国的医疗器械资质。同时人结肠癌抗原(CCA)Elisa试剂盒的诊断结论存在一定的局限性，受限于样本保存不当、实验操作不规范，方法学灵敏度等原因不能作为临床判断的唯一依据。

人结肠癌抗原(CCA)Elisa试剂盒技术原理：方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

人结肠癌抗原(CCA)Elisa试剂盒

人结肠癌抗原(CCA)Elisa试剂盒样品收集、处理及保存方法:

1.血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液:3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

5.保存:如果样本收集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存于-20℃,避免反复冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

人结肠癌抗原(CCA)Elisa试剂盒操作流程如下:

(1)待测样品孔中每孔加入待测样品100μl,每种样品设3个平行孔;设两个阴性对照孔,每孔加未处理组的细胞裂解液100μl;另设一个空白对照孔,加入纯细胞裂解液100μl。

(2)酶标板置4℃,包被过夜。

(3)洗板:吸干孔内反应液,用洗涤液过洗一遍(将洗涤液注满板孔后,即甩去),之后将洗涤液注满板孔,浸泡1-2分钟,间歇摇动。甩去孔内液体后在吸水纸上拍干。重复洗涤3-4次。

(4)阴性对照孔每孔加入PBS 50μl,样品孔及空白孔每孔加入1:500稀释的抗体工作液50μl。

(5)酶标板置37℃培养箱的湿盒内,孵育60min。

(6)洗板,同(4)。

(7)每孔加1:5000稀释的抗体工作液100μl。

(8)酶标板置37℃培养箱的湿盒内,孵育60min。

(9)洗板,同(4)。

(10)每孔加TMB显色液100μl,轻轻混匀10s,置37℃暗处反应15-20min。

(11)每孔加100μl 2mol/L H2SO4终止反应。

(12)分别测450nm吸光值W1和630nm吸光值W2,测得的OD值为两者之差(W1-W2),以减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。

(13)数据处理:在得出标本(S)和阴性对照(N)的OD值后,计算S/N值。

应用^[4][5]

人结肠癌抗原(CCA)Elisa试剂盒可以用于基于MHCⅠ类分子亲和力筛选的人结肠癌新抗原肽的临床免疫效应研究

研究通过对人结肠癌全外显子测序的生物信息学分析,预测新抗原,确定其所结合的MHC(人类为HLA)分子亲和力。体外模拟抗原提呈过程对肿瘤新生抗原肽进行免疫原性检测,阐述新抗原肽的免疫原性与其MHCⅠ类分子亲和力变化度及MHCⅠ等位基因型之间的关系。在此基础上形成快速发现有效新抗原的新方法。

方法:1.采用NGS测序技术对患者肿瘤组织进行全外显子测序,获得肿瘤的全外显子基因组数据。2.通过Net-MHC4.0等软件预测(9肽)新抗原肽,确定其所结合的MHC I等位基因和分子亲和力。3.由生物公司根据新抗原多肽的氨基酸序列,合成新抗原多肽。4.体外诱导外周血单个核细胞(PBMC)分化为未成熟树突状细胞(im DC)。5.制备负载新抗原多肽的DC疫苗。6.进行DC疫苗与PBMC共培养。7.采用人结肠癌抗原(CCA)Elisa试剂盒ELISPOT酶联斑点技术量化新抗原多肽的免疫原性。8.以流式细胞技术鉴定成熟树突状细胞(m DC)及最后共培养混合细胞中T、B、NK等各免疫细胞的百分比。

人结肠癌抗原(CCA)Elisa试剂盒结果:1.通过NGS测序技术及生物信息分析技术预测了共222种新抗原肽(来自6例结肠癌患者标本),明确了其等位基因及其MHC分子亲和力等信息。2.通过流式细胞分析技术证明成功制备92种负载新抗原多肽的DC疫苗,其中CD11c+、CD83+细胞占淋巴细胞群97.4%,CD80+、CD86+占淋巴细胞群97.4%。

3.采用人结肠癌抗原(CCA)Elisa试剂盒ELISPOT酶联斑点计数(T值)量化每种新抗原肽的免疫原性,将每个病人的T值进行标准化转化到同一量纲水平,Two-Way ANOVA分析结果:HLA亲和力变化度区间在1-4(Group B)标准化T值水平,明显高于≤1(Group A)标准化T值水平和>4(Group C)标准化T值水平,差异具有统计学意义(p<0.05),实验发现T值最高的新抗原的HLA亲和力变化度位于1-4之间。4.将每种肽的HLA-Ⅰ等位基因型进行分类,所结合新抗原肽数量最多的为HLA-Ⅰtype1,其次为HLA-Ⅰtype2,结合新抗原肽数量最少的为HLA-Ⅰtype3,Two-Way ANOVA分析结果:HLA-Ⅰtype1标准化T值水平,明显高于HLA-Ⅰtype2和HLA-Ⅰtype3标准化T值水平,差异具有统计学意义(p<0.05),实验发现T值最高的新抗原的HLA-Ⅰ等位基因型为HLA-Ⅰtype1。5.最终培养3周后的混合细胞做流式细胞分析显示:CD4+T细胞(CD3+CD4+)所占比例为37.41%,CD8+T细胞(CD3+CD8+)所占比例为16.67%,NK细胞(CD3-CD56+)所占比例为33.09%,B细胞(CD3-CD19+)所占比例为0.84%,表明新抗原肽不仅对CD8+T细胞具有增殖活化作用,同时对CD4+T细胞及NK细胞也有促进增殖作用。

参考文献

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[5]张嗣玉.基于MHCⅠ类分子亲和力筛选的人结肠癌新抗原肽的临床免疫效应研究[D].杭州师范大学,2020.