人激素敏感性脂肪酶(HSL)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人激素敏感性脂肪酶(HSL)ELISA试剂盒用于体外定量检测人血清、血浆或其它相关生物液体中激素敏感性脂肪酶(HSL)的浓度。

检测原理:本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗激素敏感性脂肪酶(HSL)抗体包被于酶标板上，实验时样品（或标准品）中的激素敏感性脂肪酶(HSL)会与包被抗体结合，游离的成分被洗去，然后依次加入生物素化的抗激素敏感性脂肪酶(HSL)抗体，HRP-链霉亲和素结合物,最后加入单组份TMB底物液。TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，激素敏感性脂肪酶(HSL)浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中激素敏感性脂肪酶(HSL)的浓度。

人激素敏感性脂肪酶(HSL)ELISA试剂盒

激素敏感性脂肪酶（HSL），以前也被称为胆固醇酯水解酶（CEH），有时被称为三酰甘油脂肪酶，是一种由LIPE基因编码的酶。HSL是一种细胞内的中性脂肪酶，能够水解各种酯类。该酶有长短两种形式。长型表达在类固醇生成组织中，如睾丸，它将胆固醇酯转化为游离胆固醇，用于类固醇激素的生产。短形式表达在脂肪组织中，除其他外，它将储存的甘油三酯水解为游离脂肪酸。在空腹状态下，脂肪细胞分泌的游离脂肪酸的增加归因于激素肾上腺素，因此被称为"激素敏感脂肪酶"。

标本要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

操作流程

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于Grb14通过HSL促进肝脏细胞脂肪分解的作用机理研究

通过免疫荧光、免疫沉淀、甘油三酯及甘油含量的测定、体外蛋白纯化、实时荧光定量PCR等分子生物学方法分别在蛋白水平及RNA水平探究Grb14在脂肪分解代谢中的作用,旨在揭示Grb14在调控脂肪分解代谢中具体的作用机理。

主要结论如下:（1）Grb14促进肝脏细胞的脂肪分解。在人源肝脏细胞HL-7702中过表达Grb14测定细胞中甘油三酯含量以及培养液中甘油的释放量,结果发现:表达Grb14的细胞中甘油三酯含量较对照组显著下调,甘油的释放量上升。其次在He La细胞中过表达Grb14检测脂滴的变化,免疫荧光结果发现:表达Grb14的细胞中脂滴的数目较对照组明显减少。因此推测Grb14的高表达,促进细胞中脂肪的分解。

（2）Grb14与HSL协同促进肝脏细胞的脂肪分解。HSL作为最先发现的脂肪酶,既往研究表明它参与甘油三酯、甘油二酯及胆固醇酯的水解。试验发现Grb14的N端与HSL的N端有相互作用,通过对肝细胞中积累的甘油三酯及培养基中释放的甘油含量的测定,发现Grb14与HSL协同促进细胞中甘油三酯的水解。免疫荧光试验得到相同的结果,单表达Grb14或HSL的细胞,脂滴含量明显减少,而共表达Grb14与HSL的细胞中,脂滴几乎完全消失。在HL-7702细胞中过表达Grb14发现,脂肪分解相关基因如ATGL,HSL、CGI-58、ADRB、ACOX和LPL在m RNA水平显著上调;敲低Grb14,大多数脂肪分解相关基因的表达显著下调。结果显示:无论在RNA水平还是在蛋白质水平,Grb14都促进肝脏细胞的脂肪分解。

（3）Grb14通过调控HSL的水解酶活性与肝脏细胞的自噬促进脂肪的分解。试验结果显示Grb14能直接影响PKA介导的HSL的磷酸化,调控HSL介导的脂滴的水解;同时,Grb14通过影响自噬标记蛋白的含量及自噬底物的积累促进肝细胞中的脂噬,为肝细胞中脂滴的分解提供新的思路。

参考文献

[1]The reduction of lipid-sourced energy production caused by ATGL inhibition cannot be compensated by activation of HSL,autophagy,and utilization of other nutrients in fish[J].Si-Lan Han,Yan Liu,Samwel M.Limbu,Li-Qiao Chen,Mei-Ling Zhang,Zhen-Yu Du.Fish Physiology and Biochemistry.2020(prep)

[2]Inhibition of ATGL in adipose tissue ameliorates isoproterenol-induced cardiac remodelling by reducing adipose tissue inflammation.[J].Takahara Shingo,Ferdaoussi Mourad,Srnic Nikola,Maayah Zaid H,Soni Shubham,Migglautsch Anna K,Breinbauer Rolf,Kershaw Erin E,Dyck Jason R B.American journal of physiology.Heart and circulatory physiology.2020

[3]KRAS controls pancreatic cancer cell lipid metabolism and invasive potential through the lipase HSL.[J].Rozeveld Cody N,Johnson Katherine M,Zhang Lizhi,Razidlo Gina L.Cancer research.2020

[4]Lipophagy-derived fatty acids undergo extracellular efflux via lysosomal exocytosis.[J].Cui Wenqi,Sathyanarayan Aishwarya,Lopresti Michael,Aghajan Mariam,Chen Chi,Mashek Douglas G.Autophagy.2020

[5]瞿敏.Grb14通过HSL促进肝脏细胞脂肪分解的作用机理[D].安徽大学,2021.