人氧化低密度脂蛋白抗体(OLAB)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人氧化低密度脂蛋白抗体(OLAB)ELISA试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本氧化低密度脂蛋白抗体（OLAb）含量。

实验原理:本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人氧化低密度脂蛋白抗体（OLAb）水平。用纯化的人氧化低密度脂蛋白抗体（OLAb）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入氧化低密度脂蛋白抗体（OLAb），再与HRP标记的氧化低密度脂蛋白抗体（OLAb）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的氧化低密度脂蛋白抗体（OLAb）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人氧化低密度脂蛋白抗体（OLAb）浓度。

人氧化低密度脂蛋白抗体(OLAB)ELISA试剂盒

准备试剂与收集血样

1.收集标本：血清、血浆（EDTA、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-70℃）保存，避免反复冻融。正常标本测定前用标本稀释液作1：1 0稀释（取2 0ul，加标本稀释液18 0ul,稀释1 0倍）。

2.标准品液配制：使用前加入1ml蒸馏水混匀，配成2 0 000U/ml的溶液。设标准管8管，管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在管中加入2000 0 U/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。

3.10×标本稀释液用蒸馏水作1:1 0倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。

4. 洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）

检测程序

1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。

2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

3.每孔中加入抗体工作液10 0ul。将反应板充分混匀后置37℃6 0分钟。

4.洗板：同前。

5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃3 0分钟。

6.洗板：同前。

7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。

8.每孔加入100ul终止液混匀。

9.30分钟内用酶标仪在45 0 nm处测吸光值。

结果计算与判断

1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。

2.以标准品20 00、100 0、500、250、125、62.5、31.2、0 U/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。

3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应OLab含量，再乘上稀释倍数1 0即可。

应用^[4][5]

用于氧化低密度脂蛋白抗体在不同糖耐量水平下的比较研究

比较不同糖耐量水平者氧化低密度脂蛋白抗体（OX-LDL抗体）水平，并观察其与稳态模型评价胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）及糖化血红蛋白（HbA-1c）的相关性，进一步说明高糖、氧化应激和糖尿病血管并发症的关系。

2．方法：通过测定葡萄糖耐量及一般生化检查、病史采集、体格检查，收集2型糖尿病患者74例，其中2型糖尿病合并大血管病变（DM+CAD）患者24例；2型糖尿病不合并大血管病变（DM-CAD）患者50例；糖耐量低减（IGT）患者41例；正常对照组（NGT）35例。采用双抗夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定ox-LDL抗体水平，采用酶法测定血糖、血脂、肝肾功能，采用放射免疫分析法测定胰岛素，采用亲和微柱层析法测定糖化血红蛋白（HbA-1c）。按HOMA稳态模型公式计算胰岛素抵抗指数：HOMA-IR=（FBG×FINS）／22．5。

3．结果：（1）（DM+CAD）组ox-LDL抗体（11．83±3．00）U／ml，（DM-CAD）组（16．11±4．23）U／ml，IGT组（23．31±4．63）U／ml，NGT组（25．12±4．94）U／ml，各组数值依次升高，（DM+CAD）组明显低于（DM无CAD）组、IGT组、NGT组，且与各组比较差异均有显著性（P＜0．01）。（DM-CAD）组明显低于IGT组、NGT组，差异均有显著性（P＜0．01），IGT组与NGT组差异有显著性（P＜0．05）。

（2）以上四组所测HbA-1c分别为（8．96±2．27）％，（7．02±1．73）％；（5．45±0．33）％；（5．14±0．36）％，各组间差异均有显著性（P＜0．01）。

（3）以上四组所测HOMA-IR分别为（8．39±2．87），（5．22±2．12），（3．19±1．11），（2．11±1．02），各组间差异均有显著性（P＜0．01）。

（4）（DM+CAD）组、（DM-CAD）组患者ox-LDL抗体均与HbAlC呈负相关，与BMI、WC、WHR、SBP、DBP、FPG、FIN、TC、TG、LDL-C、HDL-C无相关性（P＞0．05）。NGT组患者ox-LDL抗体与WC呈负相关，与BMI、WHR、SBP、DBP、FPG，FIN、TC、TG、LDL-C、HDL-C、HbAlC无相关性（P＞0．05）。

4．结论：1．ox-LDL抗体水平和动脉粥样硬化临床事件有明显相关，提示了自身免疫在动脉粥样硬化发生、发展过程中发挥重要作用。ox-LDL抗体可能成为评估AS危险的一个重要指标。ox-LDL抗体水平和外周血LDL浓度缺乏相关性，故ox-LDL抗体可能是AS一个相对独立的预测因子。

2．ox-LDL抗体在动脉粥样硬化病变的发生发展中可能具有预防和致病的双重作用。

3．胰岛素抵抗贯穿2型糖尿病发生发展进程并且在糖尿病前期就已经存在，随着血糖（PG）升高，患者胰岛素抵抗逐渐加重。

参考文献

[1]Contributions of basal and post-prandial hyperglycaemia to micro-and macrovascular complications in people with type 2 diabetes[J].Philip Home.Current Medical Research and Opinion?.2005(7)

[2]Monocyte chemoattractant protein-1 induces scavenger receptor expression and monocyte differentiation into foam cells[J].Takahiro Tabata,Shinichiro Mine,Chie Kawahara,Yosuke Okada,Yoshiya Tanaka.Biochemical and Biophysical Research Communications.2003(2)

[3]Temporal increases in plasma markers of oxidized low-density lipoprotein strongly reflect the presence of acute coronary syndromes[J].Sotirios Tsimikas,Claes Bergmark,Reinaldo W Beyer,Raj Patel,Jennifer Pattison,Elizabeth Miller,Joseph Juliano,Joseph L Witztum.Journal of the American College of Cardiology.2003(3)

[4]Proatherogenic and Proinflammatory Properties of Immune Complexes Prepared with Purified Human oxLDL Antibodies and Human oxLDL[J].G.Virella,D.Atchley,Sinikka Koskinen,D.Zheng,Maria F.Lopes-Virella.Clinical Immunology.2002(1)

[5]吕莉.氧化低密度脂蛋白抗体在不同糖耐量水平下的比较[D].天津医科大学,2008.