人表皮生长因子受体2(HER2)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人表皮生长因子受体2(HER2)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人表皮生长因子受体2（Her2）的含量。

实验原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人表皮生长因子受体2（Her2）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人表皮生长因子受体2（Her2）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人表皮生长因子受体2(HER2)ELISA试剂盒

样本处理及要求

1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

应用^[4][5]

用于EGFR、HER2在结直肠癌患者血清与组织中的表达及其临床意义分析研究

通过检测表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）和人类表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2,HER2）在大肠癌组织和外周血中的表达,探讨EGFR和HER2在CRC发生、发展中的作用,进而为CRC的诊断、预后判断提供方便、经济的检测方法。

方法：1.应用免疫组织化学法（immunohistochemical,IHC）测定76例CRC原发灶及癌旁正常组织（adjacent non-tumorous tissues,NT）及40例结直肠腺瘤组织中EGFR和HER2水平,应用酶连免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA）检测40例健康志愿者和相应CRC患者血清EGFR和HER2。

2. 分析EGFR和HER2的含量与临床病理特征的关系、两者相互之间的相关性,以及两者表达对CRC的诊断,以及判断预后的作用。

3. 采用SPSS 13.0软件进行统计分析。

结果：1.各组血清中EGFR和HER2的表达1.1正常对照组与CRC组中血清EFGR水平CRC血清EGFR浓度为（7.3±1.2）mg/L,明显高于正常组（3.5±1.5）mg/L,差异有统计学意义（t=14.845,P＜0.001）；76例CRC患者血清EGFR≥6.5 mg/L者54人,正常对照组18人,EGFR敏感度为（54/76）71.1%,特异度为（22/40）55.0%。1.2正常对照组与CRC组中血清HER2水平CRC血清HER2浓度为（9.5±2.3）mg/L,明显高于正常组（3.5±1.2）mg/L,差异有统计学意义（t=15.410,P＜0.001）血清HER2≥5.9 mg/L者68人,正常对照组,HER2≥5.9 mg/L有23人,HER2敏感度（68/76）89.5%,特异度（17/40）42.5%。2.CRC组织中EGFR和HER2的表达。

2.1 CRC组织中EGFR的表达经过IHC后,结果显示组织EGFR的阳性表达在细胞中主要在胞膜,胞质中偶有表达；组织HER2在CRC组织中表达高于在腺瘤组织（x228.382,P＜0.001）和NT中（x2=60.674,P＜0.001）；2.2 CRC组织中HER2的表达组织中HER2阳性主要表现在胞膜,少部分也可在胞质,组织HER2在CRC组中的表达明显高于NT组（x2=30.612,P＜0.001）及腺瘤组（x2=8.727,P=0.003）,差异有统计学意义。

3.CRC组织HER2和EGFR与一般临床病理特征之间关系3.1 CRC组织EGFR与一般临床病理特征之间关系CRC组织中组织EGFR的表达和Dukes分期、LNM紧密相关；但与肿瘤的组织学分型、肿瘤的具体部位、患者的性别以及患者的年龄无关；在Dukes C/D期以及LNM者的CRC组织中EGFR表达明显高于Dukes A/B期及未见其他器官组织中转移者（P＜0.05）；3.2 CRC组织HER2与一般临床病理特征之间关系CRC组织中HER2的水平也与和Dukes分期、LNM密切相关；而与肿瘤的组织学分型、肿瘤部位、性别和年龄无关；Dukes C/D期CRC组织中HER2表达较于Dukes A/B期及未见其他器官组织中转移者CRC组织中HER2明显升高（P＜0.05）；CRC组织中组织HER2的水平随着分化程度的降低反而升高,但差异无统计学意义（P＞0.05）。

参考文献

[1]Evaluation of serum HER2-ECD levels in patients with gastric cancer[J].Katsunobu Oyama,Sachio Fushida,Tomoya Tsukada,Jun Kinoshita,Toshifumi Watanabe,Masatoshi Shoji,Shinichi Nakanuma,Koichi Okamoto,Seisho Sakai,Isamu Makino,Keishi Nakamura,Hironori Hayashi,Masafumi Inokuchi,Hisatoshi Nakagawara,Tomoharu Miyashita,Hidehiro Tajima,Hiroyuki Takamura,Itasu Ninomiya,Hirohisa Kitagawa,Takashi Fujimura,Ryousuke Tajiri,Akishi Ooi,Tetsuo Ohta.Journal of Gastroenterology.2015(1)

[2]HER2-positive gastric cancer[J].Narikazu Boku.Gastric Cancer.2014(1)

[3]Over-expression of Her-2 in colorectal cancer tissue,but not in serum,constitutes an independent worse prognostic factor[J].Sang-Woo Lim,Hye-Ran Kim,Hwan-Young Kim,Jung-Wook Huh,Young-Jin Kim,Jong-Hee Shin,Soon-Pal Suh,Dong-Wook Ryang,Hyeong-Rok Kim,Myung-Geun Shin.Cellular Oncology.2013(4)

[4]HER2 testing in breast cancer:an overview of current techniques and recent developments[J].N.Pathmanathan,A.Michael Bilous.Pathology.2012(7)

[5]宋均飞.EGFR、HER2在结直肠癌患者血清与组织中的表达及其临床意义分析[D].安徽医科大学,2016.