大鼠胰蛋白酶原激活肽(TAP)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠胰蛋白酶原激活肽(TAP)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中大鼠胰蛋白酶原激活肽(TAP)的含量。

检测原理：试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。

大鼠胰蛋白酶原激活肽(TAP)ELISA试剂盒

样品收集、处理及保存方法

1.血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液:3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;

3.样本孔先加待测样本10μL,再加样本稀释液40μL;空白孔不加。

4.除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。

6.每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。

试剂盒性能

1.准确性:标准品线性回归与预期浓度相关系数R值,大于等于0.9900。

2.灵敏度:*检测浓度小于1.0 ng/mL。

3.特异性:不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重复性:板内、板间变异系数均小于15%。

应用^[4][5]

用于胰蛋白酶原激活肽和C-反应蛋白与大鼠急性胰腺炎关系的研究

通过建立大鼠急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）动物模型，对大鼠AP血清中胰蛋白酶原激活肽（trypsinogen activation peptide,TAP）和C-反应蛋白（C-reactive protein,CRP）进行动态检测，探讨血清TAP和CRP在AP发生、发展中的作用，为AP早期诊断提供理论依据。

方法：将96只SPF级健康雄性Wistar大鼠随机分为假手术组和急性胰腺炎组，每组48只。假手术组仅打开大鼠腹腔翻动胰腺数次后关腹，急性胰腺炎组用胰腺被膜下多点注射5%牛磺胆酸钠（Na-Tc）建立动物模型。各组在造模后第3小时、第6小时、第12小时和第24小时四个时点分批处死。每只大鼠处死前腹主动脉采血5ml，取部分胰腺组织进行HE染色并做病理评分。用全自动生化分析仪测定血清淀粉酶（AMY）含量；应用ELISA法定量检测各组大鼠血清TAP和CRP的含量。

结果：成功建立急性胰腺炎动物模型，AP组大鼠胰酶升高、胰腺病理损害随着造模时间的延长逐渐加重。假手术组与AP组3h比较胰腺组织病理评分的差异无统计学意义（P＞0.05）；假手术组与AP组6h、12h、24h同时点比较胰腺组织病理评分的差异有统计学意义（P＜0.05）。假手术组各时点组内两两比较胰腺组织病理评分的差异无统计学意义（P＞0.05），AP组各时点组内两两比较胰腺组织病理评分的差异有统计学意义（P＜0.05）。假手术组与AP组同时点血清TAP浓度差异比较均有统计学意义（P＜0.05），假手术组各时点血清TAP浓度差异组内两两比较均无统计学意义（P＞0.05）。AP组各时点血清TAP浓度差异组内两两比较均有统计学意义（P＜0.05）。假手术组与AP组3h血清CRP浓度差异比较无统计学意义（P＞0.05）。假手术组6h、12h、24h与AP组同时点血清CRP浓度差异比较均有统计学意义（P＞0.05）。假手术组3h与6h比较血清CRP浓度差异无统计学意义（P＞0.05），12h与24h比较血清CRP浓度差异无统计学意义（P＞0.05），6h与12h、24h比较血清CRP浓度差异有统计学意义（P＜0.05）。AP组各时点血清CRP浓度差异组内两两比较均有统计学意义（P＜0.05）。血清TAP含量、血清CRP含量均与胰腺组织病理评分呈高度正相关。

结论：血清胰蛋白酶原激活肽可作为早期准确诊断急性胰腺炎的可靠指标。急性胰腺炎早期对血清胰蛋白酶原激活肽和C-反应蛋白动态检测可判断急性胰腺炎的严重程度，对早期诊断急性胰腺炎具有良好的指导意义。

参考文献

[1]Disturbances of the microcirculation in acute pancreatitis[J].C.M.Cuthbertson,C.Christophi.Br J Surg.2006(5)

[2]Outcome of severe acute pancreatitis[J].Mark A.Malangoni,Adam S.Martin.The American Journal of Surgery.2005(3)

[3]Evaluation of Factors That Have Reduced Mortality From Acute Pancreatitis Over the Past 20 Years[J].Simmy Bank,Pankaj Singh,Nakechand Pooran,Bernard Stark.Journal of Clinical Gastroenterology.2002(1)

[4]Importance of Microcirculatory Disturbances in the Pathogenesis of Pancreatitis[J].D.Uhlmann,S.Ludwig,F.Gei?ler,Andrea Tannapfel,J.Hauss,H.Witzigmann.Zentralbl Chir.2001(11)

[5]栾涛.胰蛋白酶原激活肽和C-反应蛋白与大鼠急性胰腺炎关系的研究[D].青海大学,2012.