大鼠磷酸化蛋白激酶C(P-PKC)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠磷酸化蛋白激酶C(P-PKC)ELISA试剂盒用于测定大鼠血清、血浆及相关液体样本中磷酸化蛋白激酶C(P-PKC)活性及含量。

实验原理:大鼠磷酸化蛋白激酶C(P-PKC)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠磷酸化蛋白激酶C(P-PKC)水平。用纯化的大鼠磷酸化蛋白激酶C(P-PKC)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入磷酸化蛋白激酶C(P-PKC)，再与HRP标记的磷酸化蛋白激酶C(P-PKC)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的磷酸化蛋白激酶C(P-PKC)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠磷酸化蛋白激酶C(P-PKC)活性浓度。

大鼠磷酸化蛋白激酶C(P-PKC)ELISA试剂盒

样本处理及要求：

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）去除颗粒。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

操作程序

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔加待测样本50μL。

3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于甘油二酯激酶ζ参与大鼠胚胎神经管的早期发育研究

检测甘油二酯激酶（diacylglycerol kinase,DGK）ζ、细胞骨架在大鼠胚胎神经管形成过程中的表达变化,探讨其与神经管发育的关系。

方法:取E9.5～E12大鼠胚胎各6只,横断面连续切片,免疫组织化学方法检测胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）、巢蛋白（Nestin）和DGKζ在神经管的表达,并对GFAP和Nestin阳性细胞率进行统计学分析;免疫荧光双标法检测DGKζ、纤维状肌动蛋白（fibros actin,F-actin）和磷酸化蛋白激酶Cδ（phosphorylated protein kinase C,p-PKCδ）在神经上皮细胞的表达。

结果:1.免疫组化染色和细胞计数显示,神经干细胞（neural stem cell,NSCs）标记物GFAP早于Nestin,于E9.75开始表达,但随着胎龄增加表达逐渐减弱,且阳性细胞率逐渐降低;而Nestin则在E10.25才在神经上皮表达,E11之后随着神经沟闭合及脑泡开始发育,Nestin表达从头端到尾端逐渐增强,阳性细胞率显著升高。

2. 免疫组化染色显示,DGKζ在E9.75～E12大鼠神经上皮均有表达,但表达强度和细胞内定位随胎龄和部位发生变化。在E9.75和E10,DGKζ表达在大部分神经上皮细胞的胞浆和细胞核,但在处于分裂期的M带细胞只表达在细胞核;E10.25～E12,DGKζ在神经管塑形活跃的背外侧绞合点等区域阳性表达较强,表达于胞浆和胞核,且多位于核内。

3.免疫荧光双标染色显示,F-actin主要表达在神经上皮的胞核,DGKζ和p-PKCδ分布在F-actin阳性的微丝上。结论:随着大鼠神经管的发育,Nestin+的NSCs比例逐渐增多,DGKζ动态表达于NSCs的胞核和胞浆,核内DGKζ可能通过DAG/PKCδ途径来调节F-actin的功能。

参考文献

[1]New Insights into Cellular Functions of Nuclear Actin[J].Kloc Malgorzata,Chanana Priyanka,Vaughn Nicole,Uosef Ahmed,Kubiak Jacek Z.,Ghobrial Rafik M..Biology.2021(4)

[2]Phosphoinositides signaling modulates microglial actin remodeling and phagocytosis in Alzheimer’s disease.[J].Desale Smita Eknath,Chinnathambi Subashchandrabose.Cell communication and signaling:CCS.2021(1)

[3]From structural resilience to cell specification-Intermediate filaments as regulators of cell fate.[J].Sj?qvist Marika,Antfolk Daniel,SuarezRodriguez Freddy,Sahlgren Cecilia.FASEB journal:official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology.2020(1)

[4]Troxerutin flavonoid has neuroprotective properties and increases neurite outgrowth and migration of neural stem cells from the subventricular zone.[J].Masood Muhammad Irfan,Sch?fer Karl Herbert,Naseem Mahrukh,Weyland Maximilian,Meiser Peter.PloS one.2020(8)

[5]陶云.甘油二酯激酶ζ参与大鼠胚胎神经管的早期发育[D].山西医科大学,2022.