大鼠组织因子(TF)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠组织因子(TF)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中大鼠组织因子(TF)的含量。

大鼠组织因子(TF)检测试剂盒测定原理：

该试剂盒基于ELISA检测方法。该试剂盒中提供的微量滴定板已用组织因子(TF)预涂。在反应过程中，样品或标准品中的组织因子(TF)与组织因子(TF)特异性生物素化检测抗体上固定相载体上固定量的组织因子(TF)竞争。从板中洗涤过量的缀合物和未结合的样品或标准品，并将HRP-链霉亲和素（SABC）加入每个微孔板并孵育。然后将TMB底物溶液加入每个孔中。通过加入硫酸溶液终止酶-底物反应，并在450nm的波长下用分光光度法测定颜色变化。然后通过将样品的O D与标准曲线进行比较来确定样品中组织因子(TF)的浓度。

大鼠组织因子(TF)ELISA试剂盒

操作步骤

1.标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。

4.温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。

5.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

6.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

7.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

8.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

9.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于组织因子和自噬在慢性血栓栓塞性肺动脉高压大鼠模型肺血管重塑中的作用研究

建立慢性血栓栓塞性肺动脉高压（CTEPH）大鼠模型,检测其组织因子（TF）和自噬的表达情况,并探讨TF和自噬在CTEPH大鼠模型肺血管重塑过程中的相关性及作用。

方法:大鼠随机分为假手术组（n=45）和实验组（n=45）,根据观察时间每一组进一步分为1周（n=15）、2周（n=15）、4周（n=15）三个组;实验组中,将大鼠的自体血凝块经左颈外静脉重复注入肺动脉以诱导CTEPH动物模型;假手术组除用等量的生理盐水替代自体血凝块外,其余操作均同实验组。

注血凝块1周、2周、4周后:测量大鼠的平均肺动脉压力（m PAP）,观察大鼠肺组织病理和检测大鼠肺动脉管壁面积/管总面积（WA/TA）,应用酶联免疫法（ELISA）和发色底物法分别检测大鼠血浆TF抗原表达水平和活性水平,用免疫组织化学法检测大鼠肺动脉TF、Beclin-1和LC3B蛋白表达的部位,用逆转录-聚合酶链反应法和免疫印迹法检测大鼠肺动脉TF、Beclin-1和LC3B m RNA和蛋白的表达水平,并进行比较和相关性分析。

结果:实验组三个组大鼠m PAP和肺动脉WA/TA明显高于假手术组（18.97±3.87mm Hg vs.14.4±2.66 mm Hg,21.89±4.22 mm Hg vs.13.9±2.82 mm Hg,25.17±4.74 mm Hg vs.14.1±3.12 mm Hg;46.67±8.50 vs.31.2±6.25,49.06±8.82 vs.30.1±6.01,54.03±10.26 vs.32.8±6.83）,差异均具有统计学意义（均P＜0.05）;实验组大鼠血浆TF抗原含量（134.89±49.39 pg/ml,159.92±67.07pg/ml,174.90±53.38pg/ml）明显高于假手术组（83.24±21.90pg/ml,82.45±22.76pg/ml和83.92±24.11pg/ml）,差异均具有统计学意义（均P＜0.05）;

实验组大鼠血浆TF抗原活性（103.38±22.05p M/ml,119.54±26.70 p M/ml,117.12±19.14p M/ml）明显高于假手术组（62.62±16.06p M/ml,60.15±17.23p M/ml和61.87±16.69 p M/ml）,差异均具有统计学意义（均P＜0.05）;实验组大鼠肺动脉TF m RNA和蛋白的表达水平明显高于假手术组,差异均具有统计学意义（均P＜0.05）;实验组大鼠肺动脉Beclin-1m RNA和蛋白的表达水平明显低于假手术组,差异均具有统计学意义（均P＜0.05）;

实验组大鼠肺动脉LC3B m RNA和蛋白的表达水平明显低于假手术组,差异均具有统计学意义（均P＜0.05）;实验组大鼠血浆TF活性与肺动脉WA%呈正相关（r=0.972,P＜0.05）与m PAP呈正相关趋势（r=0.914,P＞0.05）;实验组大鼠m PAP与肺动脉WA/TA成正相关（r=0.955,P＜0.05）;实验组大鼠肺动脉Beclin-1和LC3B蛋白表达水平与WA/TA均成负相关（r=-0.963,P＜0.05;r=-0.965,P＜0.05）;实验组大鼠肺动脉TF蛋白表达水平与Beclin-1和LC3B蛋白表达水平均成负相关（r=-0.995,P＜0.05;r=-0972,P＜0.05）。

参考文献

[1]Establishment of a canine model of acute pulmonary embolism with definite right ventricular dysfunction through introduced autologous blood clots[J].Lin-Bo Zhao,Zhen-Yu Jia,Guang-Dong Lu,Yin-Su Zhu,Lei Jing,Hai-Bin Shi.Thrombosis Research.2015(4)

[2]Autophagic regulation of smooth muscle cell biology[J].Joshua K.Salabei,Bradford G.Hill.Redox Biology.2015

[3]Getting ready for building:signaling and autophagosome biogenesis[J].Adi Abada,Zvulun Elazar.EMBO rep.2014(8)

[4]Correlation of Altered Expression of the Autophagy Marker LC3B with Poor Prognosis in Astrocytoma[J].Daniel Winardi,Hung-Pei Tsai,Chee-Yin Chai,Chia-Li Chung,Joon-Khim Loh,Yung-Hsiang Chen,Ching-Liang Hsieh,Hung-Chen Wang.BioMed Research International.2014

[5]吴达文.组织因子和自噬在慢性血栓栓塞性肺动脉高压大鼠模型肺血管重塑中的作用[D].福建医科大学,2016.