大鼠环孢素A(CSA)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠环孢素A(CSA)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中大鼠环孢素A(CSA)的含量。

实验原理：试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay,ELISA）。往预先包被大鼠环孢素A(CsA)抗体的包被酶标板孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠环孢素A(CsA)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

大鼠环孢素A(CSA)ELISA试剂盒

样本处理及要求

1、血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2、血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8°C 1000g离心20分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3、细胞培养物上清或其它生物标本：1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

大鼠环孢素A(CsA)ELISA试剂盒品牌操作步骤：

1、从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2、设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3、样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4、除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5、弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6、每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7、每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于环孢素A诱导大鼠牙龈增生中CyPA，CD147，MMP-2，MMP-9的表达及意义研究

通过构建CIGO动物模型，通过免疫组织化学和Western blot的方法检测增生牙龈中CyPA、EMMPRIN（CD147）、MMP-2、MMP-9的表达，旨在探讨CIGO的发病机制。

研究方法1.选取48只SD雄性大鼠，按随机数字表法分为CsA实验组和对照组，依据每日测量实际体重实验组给予CsA注射液腹部皮下注射，对照组给予适量蓖麻油皮下注射；从开始给药起，每周观察大鼠牙龈增生情况。

2. 连续给药4周后，处死全部动物，运用影像学检查大鼠牙槽骨变化情况。

3. 分离磨牙牙龈，运用组织学的方法观察牙龈的变化。

4. 运用免疫组化的方法，检测CyPA、CD147、MMP-2、MMP-9在CsA实验组和对照组中的表达和定位。

5. 运用Western blot的方法，检测CyPA、CD147、MMP-2、MMP-9四种蛋白在CsA实验组和对照组的表达量。

结果1.大体观察结果：CsA实验组大鼠在连续注射CsA2周后，牙龈组织开始出现增生；经过CsA注射液的持续注射，4周后大鼠牙龈增生明显，牙龈外形如球状、结节状，隆起于牙齿表面，相邻牙龈乳头向牙冠方向增生明显，龈沟加深，形成假性牙周袋，牙龈组织失去正常形态，牙周探诊未见出血，无牙周附着丧失；对照组牙龈未见增生。建模成功。

2. Micro CT检查结果：实验组与对照组大鼠均无牙槽骨丧失，牙槽骨高度无变化。

3. Western blot结果：CsA实验组中CyPA、MMP-2、MMP-9蛋白表达与对照组相比明显降低，但CD147蛋白表达在两组间无明显差异。

4. 免疫组化结果：与对照组相比，CsA实验组中CyPA、MMP-2和MMP-9免疫组化阳性表达显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）；而CD147的阳性表达在两组间无明显变化，差异不具有统计学意义（P＞0.05）。

结论CsA可能通过下调CyPA的表达，影响了CyPA与CD147的相互作用，使CyPA-CD147复合物介导的MMPs信号通路受到影响，下调了MMPs的表达，抑制了胶原的降解，引起胶原生成的相对增多，形成药物性牙龈增生。

参考文献

[1]Serum cyclophilin A concentrations in renal transplant recipients receiving cyclosporine A:clinical implications for gingival overgrowth[J].Lei Jiang,Ming Jing Gao,Jie Zhou,Jing Zhao,Shu Wei Zhao,Yun Fu Zhao.Oral Surgery,Oral Medicine,Oral Pathology and Oral Radiology.2013

[2]The Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer（EMMPRIN,CD147）-a potential novel target in atherothrombosis prevention?[J].Nader Joghetaei,Andreas Stein,Robert A.Byrne,Christian Schulz,Lamin King,Andreas E.May,Roland Schmidt.Thrombosis Research.2013(6)

[3]Proteomic profiling of high glucose primed monocytes identifies cyclophilin A as a potential secretory marker of inflammation in type 2 diabetes[J].Surya Ramachandran,Anila Venugopal,Sathisha K.,Reshmi G.,Sona Charles,Divya G.,N.S.Pratap Chandran,Ajit Mullassari,M.Radhakrishna Pillai,C.C.Kartha.Proteomics.2012(18)

[4]The clinical implications of increased cyclophilin A levels in patients with acute coronary syndromes[J].Jinchuan Yan,Xuan Zang,Rui Chen,Wei Yuan,Jie Gong,Cuiping Wang,Ying Li.Clinica Chimica Acta.2012(7-8)

[5]何鑫.环孢素A诱导大鼠牙龈增生中CyPA，CD147，MMP-2，MMP-9的表达及意义[D].第二军医大学,2014.