牛葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PD)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

牛葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PD)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PD)的含量。

实验原理:牛葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PD)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被牛葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PD)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的牛葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PD)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

牛葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PD)ELISA试剂盒

标本要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

操作流程

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7. 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

8. 数据计算:以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，即为样品的实际浓度。

应用^[4][5]

用于拟南芥葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD5）基因的克隆及功能研究

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH,EC1.1.1.49），是磷酸戊糖途径个酶，也是这一途径的限速酶，它所催化的反应是生物细胞中NADPH的主要来源之一。G6PDH广泛分布于各类细胞中，是一种具有重要调控作用的胞内酶。G6PDH不仅对生物生长有着重要作用，它所提供的NADPH参与了细胞内的很多反应或循环，为这些反应提供还原力，同时G6PDH在植物的抗氧化机制中也扮演着极其重要的角色。

实验从哥伦比亚生态型拟南芥中克隆出G6PD5基因，通过构建克隆载体对其序列进行了检测和比对；为了验证G6PDH的功能，本实验构建了植物表达载体并对拟南芥进行侵染，成功培育出G6PD5超表达体系拟南芥。通过对比野生型拟南芥（At）、G6PD5超表达体系拟南芥（G6PD5）和G6PDH被抑制的拟南芥（g6pd5）的生长状况和生理指标，验证了G6PD5的对植物生长的重要作用。

结果表明，G6PD5组拟南芥在长势上略优于At组，而g6pd5组的拟南芥明显弱于其他两组。对其常态酶活的测定结果显示At组拟南芥G6PDH酶活达到27.5U/mg，G6PD5组的酶活达到52U/mg，提高了89.1%；而g6pd5组拟南芥的酶活则为17.5U/mg，降低了36.4%。

实验还将各组拟南芥进行了不同程度的氧胁迫处理，通过对不同处理条件下的不同组拟南芥幼苗中与氧化胁迫有关的小分子物质（O2-，GSH）以及相关酶（GR）的测定，对三组拟南芥的抗氧化胁迫能力进行对比。在NaCl处理下的个组拟南芥，其中G6PD5组的酶活下降幅度最小，由92.5U/mg降低到72.9U/mg，降低了21%，其他两组的G6PDH活性分别降低了55.6%、59.7%；NaHCO3处理下G6PD5组的酶活降低了70.5%，其他两组的G6PDH活性分别降低了88.9%、89.5%；H2O2处理中G6PD5组的酶活降低了23.2%，其他两组的G6PDH活性分别降低了33%、62.8%。

本实验分别选取100mmol/L NaCl、30mmol/L NaHCO3、40mmol/L H2O2处理后的拟南芥幼苗，对其O2-的含量、GSH含量、GR活性进行测定。实验结果显示，G6PD5组的拟南芥O2-增加量较小，分别增加了74%，90%，212%，At组分别增加了169%，149%，325%，g6pd5组分别增加了261%、226%、375%；G6PD5组拟南芥GSH含量分别增加了32%，38.3%，46.8%，At组分别增加了30.1%，21.3%，41.8%，g6pd5组分别增加了22.3%、-6.1%、10.6%；G6PD5组的拟南芥GR活性分别增加了75.4%，86%，23.8%，At组分别增加了55.8%，78.7%，18.3%，g6pd5组分别增加了-22.2%、-12.7%、7.9%。

G6PD5超表达体系拟南芥中无论是G6PDH还是GR得活性都会比其他两组拟南芥更稳定，这一组拟南芥可以在较大范围的胁迫程度中保持其酶活的相对稳定，且能够有效的清除对其自身有害的O2-，使O2-能够保持在较低的水平。

参考文献

[1]Reductive whole-cell biotransformation with Corynebacterium glutamicum:improvement of NADPH generation from glucose by a cyclized pentose phosphate pathway using pfkA and gapA deletion mutants[J].Solvej Siedler,Steffen N.Lindner,Stephanie Bringer,Volker F.Wendisch,Michael Bott.Applied Microbiology and Biotechnology.2013(1)

[2]Oxidative stress and condition-dependent sexual signals:more than just seeing red[J].Michael Garratt,Robert C.Brooks.Proceedings of the Royal Society B.2012(1741)

[3]Glucose‐6‐phosphate dehydrogenase,NADPH,and cell survival[J].Robert C.Stanton.IUBMB Life.2012(5)

[4]Strategies for Reducing or Preventing the Generation of Oxidative Stress[J].B.Poljsak,Antonio Ayala.Oxidative Medicine and Cellular Longevity.2011

[5]王旭.拟南芥葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD5）基因的克隆及功能研究[D].黑龙江大学,2013.