大鼠水通道蛋白4(AQP-4)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠水通道蛋白4(AQP-4)ELISA试剂盒用于测定大鼠血清、血浆及相关液体样本中水通道蛋白3（AQP3）含量。

实验原理:大鼠水通道蛋白4(AQP-4)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠水通道蛋白3（AQP3）水平。用纯化的大鼠水通道蛋白3（AQP3）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入水通道蛋白3（AQP3），再与HRP标记的水通道蛋白3（AQP3）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的水通道蛋白3（AQP3）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠水通道蛋白3（AQP3）浓度。

大鼠水通道蛋白4(AQP-4)ELISA试剂盒

大鼠水通道蛋白4(AQP-4)ELISA试剂盒的液体类标本：

包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清等。

1)血清：室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

2)血浆：应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

3)尿液：用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。

4)细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。

检测细胞内的成份时，用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

应用^[4][5]

用于水通道蛋白-3,4和钠钾ATP酶α1在不同时期大鼠肾脏的表达研究

研究在生理条件下,不同时期大鼠肾脏形态学变化及水通道蛋白3（Aquaporin 3,AQP3）、水通道蛋白4（Aquaporin 4,AQP4）和Na+,K+-ATPaseα1表达变化,为进一步探讨不同时期大鼠肾脏AQP3、AQP4和Na+,K+-ATPaseα1生理功能提供理论资料。

方法:选取孕19天（-2天）、出生1天、7天、14天、21天、28天、35天、60天、180天、420天、540天和850天Sprague Dawley（SD）大鼠肾脏,左肾用于提取总RNA,用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测AQP3、AQP4和Na+,K+-ATPaseα1在基因水平的表达。选取出生后180天、420天、540天和850天大鼠右肾,用4%多聚甲醛固定24h。苏木素-伊红（HE）染色观察出生后180天、420天、540天和850天肾脏形态学变化,免疫组织化学（IHC）染色测量AQP3、AQP4在出生后420天、540天和850天表达量并用图像分析软件等方法进行分析。

结果:（1）HE染色结果:出生后180天肾脏结构明显,随着时间增加,肾小球体积缩小,伴随肾小球分叶、肾小球基底膜增厚、管腔壁变薄、管腔内容物增加、管腔融合、细胞呈颗粒空泡状变性逐渐明显。

（2）IHC结果:肾皮质及髓质AQP3和AQP4蛋白表达量在420天较高、在540天降低、在850天再次升高,540天表达量与850天表达量之间比较有统计学意义（P＜0.05）。AQP3和AQP4在肾髓质表达量较肾皮质多。AQP3在420天表达量相对于在850天表达量较多,AQP4在850天表达量相对于在420天表达量较多。

（3）RT-PCR结果:AQP3 m RNA、AQP4 m RNA、Na+,K+-ATPaseα1 m RNA从-2天至出生后14天表达水平均较低,21天后表达量明显升高,AQP3 m RNA、AQP4 m RNA均在35天至表达高峰而后降低,AQP3 m RNA在850天表达量与出生后1天、7天、14天、21天、60天、180天和420天表达量比较均无统计学意义（P＞0.05）,但和-2天、出生后28天、35天和540天表达量比较有统计学意义（P＜0.05）。AQP4 m RNA在850天的表达量与出生后1天、7天、14天、21天、60天、180天、420天和540天表达量比较均无统计学意义（P＞0.05）,但和-2天、出生后28天和35天表达量比较有统计学意义（P＜0.05）。Na+,K+-ATPaseα1 m RNA表达量从出生21天后一直处于高表达状态,在180天出现表达高峰而后降低。850天表达量与28天、35天和60天表达量比较无统计学意义（P＞0.05）,与-2天、1天、7天、14天、21天、180天、420天和540天表达量比较有统计学意义（P＜0.05）。

参考文献

[1]Effects of intermittent fasting on age-related changes on Na,K-ATPase activity and oxidative status induced by lipopolysaccharide in rat hippocampus[J].Andrea Rodrigues Vasconcelos,Paula Fernanda Kinoshita,Lidia Mitiko Yshii,Ana Maria Marques Orellana,Ana Elisa B?hmer,Larissa de SáLima,Rosana Alves,Diana Zukas Andreotti,Tania Marcourakis,Cristoforo Scavone,Elisa Mitiko Kawamoto.Neurobiology of Aging.2015(5)

[2]Ontogeny of the mammalian kidney:expression of aquaporins 1,2,3,and 4[J].Lu Xing,Jian-Guo Wen,J?rgen Fr?ki?r,Jens Christian Djurhuus,Rikke N?rregaard.World Journal of Pediatrics.2014(4)

[3]Measuring localization and diffusion coefficients of basolateral proteins in lateral versus basal membranes using functionalized substrates and kICS analysis[J].Saw Marlar,Eva C.Arnspang,Gitte A.Pedersen,Jennifer S.Koffman,Lene N.Nejsum.BBA-Biomembranes.2014(10)

[4]A comprehensive analysis of aquaporin and secretory related gene expression in neonate and adult cholangiocytes[J].Holly M.Poling,Sujit K.Mohanty,Greg M.Tiao,Stacey S.Huppert.Gene Expression Patterns.2014(2)

[5]景兴慧.水通道蛋白-3,4和钠钾ATP酶α_1在不同时期大鼠肾脏的表达[D].遵义医学院,2016.