人细胞色素B561(CYTB561)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人细胞色素B561(CYTB561)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人细胞色素B561(CYTB561)的含量。

实验原理:人细胞色素B561(CYTB561)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人细胞色素b561(cytb561)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人细胞色素b561(cytb561)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人细胞色素B561(CYTB561)

样本处理要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于棉花细胞色素Ghb561-8-At基因的功能研究

利用已经完成测序的陆地棉遗传标准系TM-1、海岛棉品种H7124和雷蒙德氏棉基因组序列信息,通过生物信息学方法对Cytb561基因家族在这三个棉种中的数目及基因结构进行系统分析;利用H7124受黄萎病胁迫的转录组数据鉴定出一些响应黄萎病菌的Cytb561基因。通过qRT-PCR方法进一步证实Cytb561基因家族成员Ghb561-8-At在TM-1和H7124中的表达响应黄萎病胁迫。

利用TRV病毒介导的基因沉默研究了Ghb561-8-At在棉花抗黄萎病中的功能,发现沉默Ghb561-8-At提高了陆地棉的黄萎病抗性,而在拟南芥中过表达该基因则提高了拟南芥的感病性,表明Ghb561-8-At在棉花抗黄萎病中起负调控作用。另外,Ghb561-8-At过表达拟南芥植株抽薹及开花提前,揭示Ghb561-8-At在调节植物生长方面具有重要作用。利用陆地棉品种W0为受体,通过农杆菌介导的遗传转化获得Ghb561-8-At过表达及沉默的棉花转基因植株,为进一步研究Ghb561-8-At在棉花生长发育和黄萎病抗性中的功能奠定了基础。

具体研究结果如下:（1）通过生物信息学方法在已测序的三个棉种,雷蒙德氏棉,陆地棉TM-1和海岛棉H7124中共鉴定出了86个Cytb561家族成员,其中在二倍体雷蒙德氏棉中得到20个,异源四倍体陆地棉和海岛棉中分别得到34个和32个。参考拟南芥Cytb561分组方法,将棉花Cytb561基因分为B族、F族和G族。其中B族含有20个,F族含有51个,G族含有15个。Cytb561基因编码的氨基酸长度在400aa左右,分子量为40kDa左右,等电点均值为9,大部分预测为碱性蛋白质。亚细胞定位预测Cytb561家族大部分基因定位在胞外,可能为分泌蛋白。通过对陆地棉转录组数据分析发现F族多数基因在棉花各组织之间均有较高的表达水平,少数在根和胚珠中表达较高。Cyt b561家族基因结构分析大部分基因含有3～4个外显子。亚组的保守结构域分析发现每个基因内都有几个非常保守的Motif。在黄萎病菌胁迫下,Cytb561在海岛棉受黄萎病菌诱导基因有21个,其中F族中17个表达上调,2个表达下调。表明F族基因在棉花响应黄萎病菌胁迫方面起着重要作用。

（2）陆地棉Ghb561-8-At属于F族,响应黄萎病菌胁迫诱导。qRT-PCR进一步查明该基因在陆地棉TM-1黄萎病菌诱导早期显著下调表达;而在海岛棉海7124中,黄萎病菌诱导早期响应不明显,在诱导48h和72h后显著上调表达。利用VIGS技术,在陆地棉TM-1中沉默Ghb561-8-At基因,以明确其在棉花对黄萎病菌的抗性中的作用。与CK和TRV::00相比,该基因沉默后,棉花对黄萎病菌的抗性显著增强。进一步研究发现,Ghb561-8-At沉默后接菌处理,棉花PR1,PR2和PAL基因的相对表达量均比对照表达水平显著升高,表明沉默Ghb561-8-At可能提高植株体内的水杨酸含量,进而提高棉花黄萎病抗性。

（3）Ghb561-8-At蛋白N端含DOMONCIL 1-like结构域,C端为Cytb561FRRS 1结构域。为了明确细胞色素b561的两个结构域功能特征,分别构建35S::Ghb561-8-At,35S::DOMONCIL1和35::Cytb561FRRS1等三个载体进行转基因研究。结果表明,35S::Ghb561-8-At和35::Cytb561FRRS1过表达转基因拟南芥植株均表现为抽薹及开花提前。而过表达DOMONCIL1-like结构域则导致植株生长发育延迟,表明Cytb561FRRS1结构域在调节拟南芥生殖发育方面起主要作用。接种黄萎病菌结果表明,在拟南芥中过表达Ghb561-8-At显著提高了拟南芥的感病性。

参考文献

[1]The Involvement of Jasmonic Acid,Ethylene,and Salicylic Acid in the Signaling Pathway of Clonostachys rosea-Induced Resistance to Gray Mold Disease in Tomato.[J].Wang Qiuying,Chen Xiuling,Chai Xinfeng,Xue Dongqi,Zheng Wei,Shi Yuying,Wang Aoxue.Phytopathology.2019(7)

[2]Transfer of tomato immune receptor Ve1 confers Ave1-dependent Verticillium resistance in tobacco and cotton.[J].Song Yin,Liu Linlin,Wang Yidong,Valkenburg Dirk-Jan,Zhang Xianlong,Zhu Longfu,Thomma Bart P H J.Plant biotechnology journal.2018(2)

[3]Salicylic acid-dependent immunity contributes to resistance against Rhizoctonia solani,a necrotrophic fungal agent of sheath blight,in rice and Brachypodium distachyon.[J].Kouzai Yusuke,Kimura Mamiko,Watanabe Megumi,Kusunoki Kazuki,Osaka Daiki,Suzuki Tomoko,Matsui Hidenori,Yamamoto Mikihiro,Ichinose Yuki,Toyoda Kazuhiro,Matsuura Takakazu,Mori Izumi C,Hirayama Takashi,Minami Eiichi,Nishizawa Yoko,Inoue Komaki,Onda Yoshihiko,Mochida Keiichi,Noutoshi Yoshiteru.The New phytologist.2018(2)

[4]Structural insight of dopamineβ-hydroxylase,a drug target for complex traits,and functional significance of exonic single nucleotide polymorphisms.[J].Abhijeet Kapoor,Manish Shandilya,Suman Kundu.PLoS ONE.2017(10)

[5]曾建国.棉花细胞色素Ghb561-8-At基因的功能研究[D].南京农业大学,2019.