质粒DNA提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

质粒DNA提取试剂盒采用改进的SDS碱裂解法，结合DNA磁珠选择性吸附DNA的方法，达到快速纯化质粒DNA的目的。适合从1-4mL细菌培养物中提取多至20μg高纯度的质粒DNA，用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。

质粒DNA提取试剂盒

操作流程

使用前准备70%乙醇,次使用前，RNase A全部加入Buffer S1中，4℃储存;

准备无核酸和核酸酶污染的Tip头等耗材;异丙醇;

操作流程

1.次使用前，RNase A全部加入Buffer S1中，4℃储存。

2.取1-4mL在LB培养基中培养过夜的菌液（若使用丰富的培养基，菌液体积应减半或更少），12000g离心1min，弃上清。

3.用100μL已加入RNase A的Buffer S1悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。

4.加入100μLBuffer S2，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12000g离心10min。

5.吸取125μL步骤4中的离心上清于一新的1.5mL离心管中。

6. 加入40μL beads和60μL的异丙醇，用枪头吹打3-5次。

7.室温放置5min,放置过程中，用枪头吹打混合2-3次。

8.将反应管置于磁力架上静置30s，直至磁珠完全吸附至管壁，上清清澈后，吸弃液体。

a）注意勿将磁珠吸出

b）弃液体后，勿将反应管从磁力架上取出

9. 加入200μL70%乙醇，在室温下放置30s，吸弃液体。重复操作1次。

a）注意勿将磁珠吸出

b）注意在磁力架上操作，勿从磁力架上取出反应管

c）请务必吸尽反应管内残留的液体

10.让磁珠在室温下干燥3-5min.

a）注意在磁力架上操作，勿从磁力架上取出反应管

b）在室温下翻转取出残留的乙醇

c）勿使磁珠过分干燥，否则将影响DNA得率

11.移去磁力架，加入60-100μL Eluent或去离子水，用移液器吸头轻轻吹打管壁磁珠，直至分布均匀，静置2min。

12.将反应管置于磁力架上，静置直至磁珠全部吸附至管壁，吸取上清至一新的离心管中，即得高纯度的DNA。

应用^[4][5]

用于单增李斯特菌质粒DNA定性标准物质的研制及在银耳检测中的应用

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）,是一种常见食源性病原菌,是李斯特菌属中致病力最强的革兰氏阳性无芽孢杆菌,可引发多种疾病,致死率高（20%～30%）,在熟食、水产产品、冷冻食品及食用菌中均有检出,因此快速检测和诊断单增李斯特菌对食品安全意义重大。但食源性致病菌的传统检测方法耗时长、检测限低,不利于致病菌的快速检测。

近年来针对转基因作物和病毒开发出基于核酸标准物质检测技术,能够使核酸扩增检测方法标准化,提高实验室间检测结果一致性和准确性。而我国在核酸标准物质的研制方面刚刚起步,数量和种类远远不能满足当前市场及监督检验的需求,对于单增李斯特菌毒力基因检测相关质粒定性标准物质的研制更是少之又少。

通过提取单增李斯特菌标准菌株全基因组DNA,以此作为模板对毒力基因引物hly A、prfA1、prfA2进行PCR扩增,回收这3种毒力基因扩增的目的片段;分别克隆至载体p LB-simple Vector中,构建分别含有对应毒力基因的重组质粒;通过菌落PCR和测序对重组质粒进行检验,将转化成功的重组质粒进行质粒提取并保存,大量提取质粒进行冻干,制成冻干粉,即初步得到用于检测单增李斯特菌的质粒标准品。

根据菌落PCR和测序验证结果显示,本研究成功构建出含有hly A、prfA1、prfA2毒力基因的质粒标准物质,浓度、纯度和稳定性均达到要求。且在长期稳定性实验检测中,质粒标准物质的稳定性良好。同时发现PCR的敏感性受靶基因的影响,不同毒力基因的检测限也不同。

将构建含有hly A、prf A1、prfA2毒力基因的质粒标准品作为阳性对照用于对30批次银耳样品的检测,有1批样品检测出prfA1和prfA2,检出率为3.3%。并对检测结果呈阳性的银耳样品通过传统微生物检测方法验证,但传统检测方法没有获得目标菌株,可能是在环境胁迫或优势菌株的存在下,目标菌株进入休眠或是VBNC状态。此种状态下的菌株在传统检测方法下不易被检出,大大降低了检出率,同时说明了PCR方法的灵敏度高于传统检测方法。

参考文献

[1]Combined Enrichment and Quantitative Polymerase Chain Reaction to Improve Sensitivity and Reduce Time of Detection of Listeria monocytogenes in Mushrooms.[J].Lee Yewon,Yoon Yohan,Seo Yeongeun,Kim Sejeong,Ha Jimyeong,Lee Jeeyeon,Choi Yukyung,Oh Hyemin,Kim Yujin,Kang Joohyun,Park Eunyoung,Kim Won-Il,Lee Soomin.Foodborne pathogens and disease.2020(4)

[2]Listeria monocytogenes and other Listeria species in raw milk and sausage in East Algeria[J].L.Benhalima,T.Merad,M.Bensouilah,R.Ouzrout.Asian Journal of Dairy and Food Research.2019(1)

[3]The European Union summary report on trends and sources of zoonoses,zoonotic agents and food‐borne outbreaks in 2017[J].EFSA Journal.2018(12)

[4]Antimicrobial mechanism of clove oil on Listeria monocytogenes[J].Haiying Cui,Chenghui Zhang,Changzhu Li,Lin Lin.Food Control.2018

[5]马盼盼.单增李斯特菌质粒DNA定性标准物质的研制及在银耳检测中的应用[D].河南大学,2020.